切片制作方法

切片制作步骤取材与分割→固定→洗涤→脱水→透明→浸蜡和埋蜡→切片→粘片→脱蜡→染色→脱水→透明→封片1、固定液（1）FAA：福尔马林—冰醋酸—酒精50%或70%乙醇90mL+冰醋酸5mL+福尔马林（37%-40%甲醛）5mL固定时间最短需10h，一般不低于24h，可兼做保存液幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，可防止材料收缩。如材料坚硬，可略减冰醋酸，略增福尔马林；如材料易收缩，可稍增冰醋酸。久置时可加5mL甘油，以防止蒸发和材料变硬。如果用在植物胚胎的材料上，改用下面的配方，效果更好：50%乙醇89mL+冰醋酸6mL+福尔马林（37%-40%甲醛）5mL（2）卡诺氏固定液：酒精—醋酸—氯仿配方1：纯酒精3+冰醋酸1（3:1）配方2：纯酒精6+冰醋酸1+氯仿3（或纯酒精30mL+氯仿5mL+冰醋酸10mL）一般材料不超过24h，固定根尖和花药只需40-60min，固定后用95%酒精（85%酒精）冲洗，每级20min;如不能立即处理，需转入70%酒精中保存。2、洗涤：FAA固定液无需洗涤直接脱水。3、脱水：材料中含水，水与石蜡不能混合，通常由50%、70%、80%、90%、无水乙醇，每次1h，其中无水乙醇需2次。材料大的需延长脱水时间（一般此后进行预染色）4、透明：常用透明剂为二甲苯和氯仿。先经乙醇和二甲苯混合液（1/2乙醇+1/2二甲苯），后纯二甲苯（2次），每次1-2h氯仿不宜在染色后透明。5级进行;1/5氯仿（4/5无水乙醇）→2/5→3/5→4/5→纯氯仿（2次）每级3-4h；最后一次纯氯仿中，放入纯石蜡粉末数次，盖好瓶盖，36℃温箱36h，使材料慢慢浸蜡。5、浸蜡、包埋：石蜡必须纯净、不含杂质；浸蜡是使石蜡逐渐取代透明剂石蜡:熔点52-56℃，一般50-60℃选用与乙醇和石蜡均能互溶的有机溶剂，如二甲苯，温箱设置高于石蜡熔点2℃25%→50%→75%（石蜡、二甲苯溶液）材料透明好后，换入新的二甲苯，然后加入等体积的碎蜡，40℃温箱，不断加入碎蜡至饱和，然后升温保持3-5h，其间换纯蜡3次，每次约1-2h。（30min也可）包埋是将材料和石蜡一块倒入小盒中，用加热的镊子迅速将材料按需要的切面和一定的间隔排列整齐，将小盒放入冷水中，凝固6、修块：包埋好的材料，按需要的切面将蜡块切成梯形，然后用蜡铲把蜡块底部牢固的粘在木质蜡座上7、切片：需先用切除的蜡块试刀，确定刀的斜度为5°-8°为宜。一经调整合适后吗，就不要随便动，以免每次试刀。（8-15μm）8、粘片：在干净的载玻片上，滴一小滴蛋清甘油（或0.3%明胶水），然后加几滴3%福尔马林或蒸馏水，用解剖针或镊子轻轻将蜡片放在液面上，再将带有蜡片的载玻片放在温台上，温台的温度在45℃左右，蜡片受热后慢慢伸直，用滤纸吸去多余液体，表面烤干，转入30℃温箱一昼夜9、脱蜡：二甲苯脱蜡。顺序：二甲苯→二甲苯→1/2二甲苯+1/2纯乙醇→100%乙醇→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→30%乙醇→蒸馏水→染色，以上每级需要5-10min10、染色：（1）铁帆—苏木精染色法（细胞学和胚胎学研究）4%铁帆媒染30min→自来水洗涤数次→蒸馏水洗涤数次→苏木精染色1-2h→自来水洗涤数次→蒸馏水洗涤数次→2%铁帆分色、并在显微镜下镜检→分色后立即用自来水冲洗30min→蒸馏水洗涤数次→30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→85%乙醇→95%乙醇（尽量用吸水纸在切片边缘将溶液吸净、以免带水）→100%乙醇（尽量将边缘溶液吸净、以免带水）→1/2甲苯→纯二甲苯（2次）→中性树胶封片注：①每道工序约3-5min②苏木精用无水乙醇配制成10%的母液，经一个月的氧化后方可使用，用时稀释到0.05%（2）番红—固绿染色法70%乙醇→1%番红6h或过夜（用50%乙醇配制）→70%乙醇→85%乙醇→→95%乙醇→0.5%固绿5-30s（60s）或用滴染法（95%乙醇配制）→95%乙醇（10min、吸水纸吸尽边缘溶液）→100%乙醇（10min、吸水纸吸尽边缘溶液）→1/2二甲苯+1/2无水乙醇→纯二甲苯（2次）→中性树胶封片溶液配制：1%番红溶液：1g番红，溶于99ml蒸馏水中0.5%固绿溶液：取0.5g亮绿，溶解在100ml蒸馏水中10、脱水、透明脱水时间要短，因为乙醇有褪色作用11、封片常用固封剂为加拿大树胶固封方法：（1）准备好清洁盖片、镊子、树胶、白布等（2）用白布小心擦拭已经透明好的带有标本的载玻片，并在其上滴一滴加拿大树胶（3）用镊子夹持一个清洁的盖玻片，一端先与树胶滴接触，然后缓慢放下盖片，使整个树胶充满盖片（4）将封好的切片放至烤片夹中，放入温箱（40℃）中烘干。