电镜技术

免疫电子显微镜技术0.2mm0.2μm0.2nm像差、衍射效应像差电镜基本技术•取材关键快、准、轻、小1mm3组织块取材，固定，脱水，浸透，包埋，切片，染色•固定戊二醛—锇酸双重固定保存组织的精细结构•脱水丙酮、乙醇梯度脱水•包埋包埋剂—多用环氧树脂类高温聚合（60oC恒温箱）•切片超薄切片50nm±粘附于铜网上•染色“电子染色”结构图像之间的反差醋酸铀—柠檬酸铅双染色法重金属盐类染色剂•电镜观察免疫电镜（Immunoelectronmicroscopy,IEM）免疫细胞化学反应高电子密度亚细胞水平定位抗原（抗体）探讨：病因、发病机制，组织发生注意结合光镜免疫电子显微镜技术X45,000→←X7,500标记物酶、铁蛋白、胶体金1.酶标记－HRP(40KD)小，易穿透，稳定通过戊二醛（过碘酸钠），将抗体IgG或SPA与HRP交联直接法、间接法、PAP法、ABC法等均可Fab’－HRP分子量小（70KD）利于抗体穿透优点：可借鉴免疫组化（光镜）所用之试剂、操作步骤、及所示结果，易获成功缺点：弥散，密度较低，定位精确性较差，不宜对比染色PDGF-R2.铁蛋白12nm颗粒（大），中心是Fe(OH)3外围蛋白质分子量大（440KD），穿透力差易与环氧树脂非特异吸附而出现背景“着色”3.胶体金理想2HAuCl4+3H2O22Au–+8HCl+3O2(还原剂)胶体金颗粒（溶胶)——AuIgG(IG)AuSPA(PAG)密度梯度离心柱层析（S－400）去除大颗粒聚合物及未标记蛋白还原剂白磷5nm抗坏血酸8～13nm枸橼酸钠15nm双标或多标TNF-R1×21000VWF×73000TNF-R2×46000胶金标记之优点：①抗体活性高②可作光镜对照观察（免疫金银法）③可作对比染色，超微结构清晰④可作双标或多标记⑤颗粒可定量计数注意：⒈间接法时，一抗不能用Fab’；用PAG时，一抗不能用羊IgG⒉小颗粒（5nm）胶体金不易观察包埋前法（浸透法）免疫细胞化学反应→超薄切片制备→电镜观察（厚片）包埋后法（浅表法）超薄切片制备→免疫细胞化学反应→电镜观察（固定、脱水、包埋、超薄切片）不包埋法冰冻超薄切片→免疫细胞化学反应→电镜观察包埋前法1.取材：新鲜、1mm3（脑、脊髓灌注固定后取）2.固定与切片：①前固定：处理好“保持抗原性与保持超微结构”的矛盾②复合固定液的应用PG固定液：1～4%Paraformaldehyde0.01～0.2％GlutaraldehydePLP固定液：Periodate-lysine-Paraformaldehyde（配制方法见附录）③厚切片（10～40μm）振动切片机的应用，或浸泡于20～30%蔗糖溶液、速冻、冰冻切片④继续固定4℃4～5h⑤彻底清洗4℃PBS(含2～5％蔗糖)过夜3．免疫细胞化学标记注意：①用漂染②增加抗体浓度（4～5倍）③1%BSA的应用④用免疫酶标时，免用H2O2⑤想方设法增加抗体之穿透力①去垢剂的应用0.01～0.2%Saponin或TritonX-1005-10’②反复冻融先浸泡于20％甘油或蔗糖（或10％DMSO），液氮速冻，室温溶解，重复2～3次③增加PBS的离子浓度④应用Fab’－HRP以减少抗体分子量⑤延长作用时间，4℃过夜⑥反复脱水、水化（不适用于膜受体的研究）增加抗体穿透力的措施4.超薄切片制备⒈1％锇酸后固定，1h⒉0.01mol/LpH7.4二甲砷酸钠缓冲液内过夜⒊脱水、浸透（适当压缩时间）⒋包埋、聚合⒌超薄切片（如为免疫酶标，不作对比染色，应尽早电镜观察）包埋后法制备超薄切片→免疫细胞化学染色（镍网或金网）（无需脱树脂）优点：简便、重复性好、可作多标记缺点：操作过程中抗原性受损，阳性率低对策⒈改用PG、PLP固定⒉改用亲水、低温聚合包埋介质常规用环氧树脂类（epoxyresins）包埋介质如epon，spurr，araldite等，疏水、60℃高温聚合改用丙烯酸树脂类（acrylicresins）包埋介质脱水无需太净，粘性小，聚合温度低，非特异性吸附少如LRWhite48～50℃聚合LowirylK4M-35℃聚合紫外光照启动聚合HM20/80-50℃聚合紫外光照启动聚合HM23-80℃聚合紫外光照启动聚合不包埋法（冰冻超薄切片法）兼具包埋前法及包埋后法的优点步骤：1.小块组织1～4％多聚甲醛固定（增加组织硬度）2.浸泡于2.3mol/L蔗糖溶液，平衡渗透压3.包埋于10％明胶，液氮速冻，超薄切片（50～60nm）4.置镍网免疫细胞化学染色双标记或多标记选包埋后法，金标记（针对不同抗原标以不同直径之胶金颗粒），如用间接法，标以不同直径胶金颗粒之二抗如来自同一种类动物时，防止叠加污染之方法有：1．双面分别标记，谨慎操作2．分步固定（灭活）第一重特异一抗过量金标记二抗多聚甲醛固定（饱和第一重一抗之Fc）（灭活二抗中未被中和之Fab）第二重特异一抗第二重金标记二抗IEM技术除广泛应用于透射电镜外亦可应用于扫描及冷冻蚀刻电镜技术（略）IFNg-RIgGΚ，λ