南开大学实用核磁技术 lecture 7---NOESY

NuclearOverhauserOffect(NOE)NuclearOverhauserOffect(NOE)AlbertW.Overhauser顺反构型立体构型芳香环的指定当两个核在空间上很接近时，可以通过偶极－－偶极作用相互影响。NOE反应原子核自旋之间通过空间的偶极－偶极相互作用;如果两个1H核间的距离小于5Å，那么在NMR谱中就可以观察到NOE信号(在蛋白质中也可观察到小于或等于6Å的NOE信号)I∝1/dij6I–两个1H核间的NOE信号强度dij–两个1H核间的空间距离NuclearOverhauserOffect(NOE)NuclearOverhauserOffect(NOE)当两个核AX在空间上很接近时，可以通过偶极－－偶极作用相互影响。选择A的频率照射，会影响X的能级分布，从而改变其信号强度。NuclearOverhauserOffect(NOE)aabbabbaX1X2A2A1W2W0单量子数驰豫W1不产生NOE效应。双量子数驰豫W2和零量子数驰豫W0产生NOE效应。小分子运动速度快，采取W2方式：能级上的分布数量增加，给以足够的时间，能级上的分布数量也会增加。正向NOE效应大分子运动速度慢，采取W0方式：能级上的分布数量增加，给以足够的时间，能级上的分布数量也会增加。反向NOE效应NuclearOverhauserOffect(NOE)当两个核在空间上很接近时，可以通过偶极－－偶极作用相互影响。NOE有正负,小分子一般有正向的NOE,大分子有反向的NOE.NuclearOverhauserOffect(NOE)影响NOE大小的因素：核共振频率v0分子在溶剂中的移动性能tc核间的空间距离，r－6COOHHCH3CH3{Me–cis}=+19%{Me–trans}=-2%{Ha}=+45%1DNOE优点：时间短，结果直接可定量缺点：需要分别激发，无法一次得到全部结果需要对NOE有估计1DNOE1DNOE13------15a,12,1415a-----15b,14,162DNOESY2DNOESY2DNOESYH3CSNO2HH3CSNO2HH3CSNO2H7.98H3CSNO2H6.292DNOESY2DNOESY8-7,127-18,18'3-5,105-11,16,18'9-10,17,17'10-1611-18,16,14,18'18-13,18'16-14,1713-14,17,17'13'-17,17'17-17'2DNOESY2DNOESY2DNOESYTOCSY(solidlines)andNOESY(dottedlines)AVANCE9002.0mMLysozymeNOESYNOE实验对环境变化非常敏感，为了得到高质量的谱图，有如下建议1）高质量的样品。样品的分子量最好小于800或者大于2000。不然NOE信号会很小。在这种条件下，最好做ROE实验。2）样品稳定性好。3）高质量的核磁管4）最好预先超声或者通氩气除氧5）NOE实验过程中最好做到恒温。NuclearOverhauserOffect(NOE)RotatingFrameOverhauserEffectSpectroscopy（ROSEY）ROESY可以理解为旋转坐标系中的NOE,由于实验室坐标系中的交叉弛豫速率在小分子为正，在大分子为负，在中间大小的分子(分子量1000～3000)，如小肽接近零，因此中间大小的分子NOE交叉峰非常弱乃至消失,这时可以用ROESY得到距离信息.但是ROESY实验受频偏等因素影响大，而且有一部分反映了耦合关系,难以定量，解析时需要小心。ROSEY与NOESY的区别：1）分子量在1000-3000范围，建议使用ROESY；小于1000和大于3000的化合物宜做NOESY。2）NOESY是相敏图,在对角峰附近的分辨率较差；3）ROESY得到的都是吸收谱，因此有相信号点(交叉峰)距离对角峰近的可以考虑使用ROESY。ROSEYROSEYTimeDependenceofNOE-MixingTimesNOEdynamicallybuildsupandthendecaysduetorelaxationduringthemixingtime1)smallmolecules0.5-1sec.Startwith0.5sec.2)mediumsizemolecules0.1-0.5sec.Startwith0.25sec.3)largemolecules0.05-0.2sec.Startwith0.1sec.同一分子中不同的NOE关系,其混合时间略有不同.如果要得到完美的NOE谱,需要采用不同的混合时间做一系列谱.一般情况下选择0.3-0.5sec.关于NOE的几点注意1、为测定NOE，需要对样品的核磁谱图有准确的指认。最常用的是同核NOE，故需要指认好氢谱。2、NOE的测定有一维谱和二维谱两大类。一维谱是作NOE的差谱。二维谱的方式即测NOESY或ROESY。3、NOE的具体数值除和研究的分子密切相关外，也和仪器（工作频率）、实验条件等有关，因而准确性和相互可比性不够好。4、NOE信息的价值与两个相关的磁性核跨越的化学键的数目有关。当两核越是跨越了多根化学键还显示NOE时，这越能排除相对多的构型、构象可能性，因而较重要的立体化学信息。5、在应用NOE时，常有某些预定的分子模型，根据NOE的结果可以从中作出明确的抉择。关于NOE的几点注意6、NOE最适合刚性分子。在这种情况下，核组之间具有确定的距离。7、若样品为柔性分子，相对于核磁共振的时标，分子在溶液中存在较快的构象互变，NOE测定的是一个平均结果，因而无法得到具体的构象信息。此时可以考虑下列方法：1）作变温实验，使体系温度降低，如果样品在溶液中有优势构象，可能得到NOE结果。2）加入使溶液变稠的物质，如SDS(十二烷基磺酸钠)，使得构象转换的速率降低。3）将样品分子作化学修饰，即将其结构稍加变化以便测定NOE。其它种类的二维核磁HOHAHA（同核全相关谱）:测定样品分子中所有偶合质子关系的化学位移相关谱。GHSQC（检测1H的梯度增益异核单量子相关谱）测定样品分子中，碳氢的直接相连关系。COLOC（检测1H的异核远程相关谱）测定样品分子中，中远程碳氢相关关系。INADEQUATE（低丰度核双量子跃迁实验）测定样品分子中，低丰度核的相关关系。常见核磁原子核的化学位移范围1HTMS0-1513CTMS0-22015NNH3（l）0-90017OH2O-50-170019FCFCl3-280-25029SiTMS-380-8031P85％H3PO4-480-27014Nand15NNMR15N能够产生很尖锐的核磁信号，但灵敏度很低。14N灵敏度相对较高但核磁信号峰非常宽，以至于在很多情况下无法分析。14Nand15NNMR14NNMRI=1Naturalabundance99.63%ReferencecompoundNH3liquidReceptivityrel.to1Hatnaturalabundance1.01×10-3Receptivityrel.to13Catnaturalabundance5.7414NNMR14N的高对称性小分子的信号宽度一般在几十或几十赫兹的范围内，而不对称的大分子的峰宽可能达到1000赫兹上下。因此一般用来区分很小的分子和N2。15NNMR15N的灵敏度非常低，但可以得到尖锐的信号。一般使用很大浓度的溶液或同位素标定的化合物进行研究。驰豫时间一般很长（几十秒），需要长的d1，或添加驰豫试剂I=1/2Naturalabundance0.37%Referencecompound90%CH3NO2inCDCl3orliquidNH3Receptivityrel.to1Hatnaturalabundance3.85×10-6Receptivityrel.to13Catnaturalabundance0.021915NNMR15NNMRspectrumofsodiumazide(1M)inD2O15NNMRspectrumofenrichedHIV-1protease276.9N2–HN3243.1N1H–O245.3N3H231PNMRI=1/2Naturalabundance100%Referencecompound85%H3PO4inH2O=0ppmReceptivityrel.to1Hatnaturalabundance6.67×10-3Receptivityrel.to13Catnaturalabundance37.7化学位移值交叉，规律性不强，要多查阅文献数据。PBu3-32.5ppmPiBu3-45.3ppmPsBu37.9ppmPtBu363ppm31PNMR与质子的耦合使峰变宽一键耦合常数为200-700Hz，二键耦合常数为0.5-20Hz。29SiNMRI=1/2Naturalabundance4.68%Receptivityrel.to1Hatnaturalabundance3.68×10-4Receptivityrel.to13Catnaturalabundance2.1629SiNMRTMSSiHCl3一键耦合常数一般在几百赫兹的级别上。二键耦合常数为6.6Hz。29Si-NMRspectrumofTMSinCDCl319FNMRI=1/2Naturalabundance100%ReferencecompoundCFCl3=0ppm，CF3COOH=-78.5ppmReceptivityrel.to1Hatnaturalabundance0.83Receptivityrel.to13Catnaturalabundance471619FNMR金属有机核磁Organolithium6Li:Q=8.0*10-4a=7.4%I=16Li:Higherresolution7Li:Q=4.5*10-2a=92.6%I=3/27Li:HighersensitivityRef:1Mor0.1MLiClinD2O金属有机核磁Boron10B:Q=8.5*10-2a=19.6%I=311B:Q=4.1*10-2a=80.4%I=3/211B:HighersensitivityRef:Et2O·BF3金属有机核磁11Bcoupling10B:Q=8.5*10-2a=19.6%n=10.7I=32nI+1=72nI+1=411B:Q=4.1*10-2a=80.4%n=32.1I=3/2NaBF4/D2O19F-NMR11BF410BF4JBF=0.5HzJBF=1.4Hz