ELISA技术

ELISATechnology2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.2一，免疫学基础概念ELISA技术(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)是一种免疫学测定，主要通过抗原抗体反应检测液体标本中的抗体或抗原性物质，是一种应用免疫学技术测定标本中目地蛋白性质、功能及含量的方法。2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.3抗原（Antigen）抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后，可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫。在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质。一，免疫学基础概念2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.4半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖和所有的类脂都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种纯蛋白的分子（载体）结合，纯蛋白会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。半抗原一旦与纯蛋白结合，就构成该蛋白质的一个抗原簇。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物质（如青霉素、磺胺剂等），称为简单半抗原。当简单半抗原进入过敏体质的机体时，能与体内组织蛋白结合，成为完全抗原，这种完全抗原可引起超敏反应。一般来说，B淋巴细胞识别半抗原决定簇，T淋巴细胞识别载体抗原决定簇。2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.5抗体（Antibody）抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM一，免疫学基础概念2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.6抗原抗体反应•a,可逆性•b,最适比例•c,特异性•d,敏感性一，免疫学基础概念2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.7抗体的产生•机体受抗原刺激后，B淋巴细胞产生相应的抗体。含有抗体的血清称为抗血清（antiserum）。每一系B细胞只产生针对某一抗原决定簇的抗体。如将多种抗原或含有多个抗原决定簇的抗原注入机体，则将由多系的B细胞产生相应的多种抗体，这些抗体均存在于免疫血清中。免疫测定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔、羊或马制得。•产生抗体的B细胞可在体外与繁殖力强的肿瘤细胞融合成杂交瘤细胞。将单个杂交瘤细胞分离，在体内或体外培养而分泌的抗体单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb或Mab）。单克隆抗体仅针对一种抗原决定簇，具有很高的特异性。单克隆抗体通常用抗原免疫小鼠制备。将免疫的脾细胞（含产生抗体的B细胞）与小鼠肿瘤细胞融合，分离杂交瘤细胞，接种于小鼠腹腔，产生的腹水中含有浓度很高的单克隆抗体。一，免疫学基础概念2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.8二，ELISA的类型•ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即“免疫吸附剂”（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）；（3）酶反应的底物（Substance）。2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.9ELISA技术（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay）一、概述1.间接ELISA（IndirectELISA）2.夹心ELISA（SandwichELISA）3.竞争ELISA（CompetitiveELISA）2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.10已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上待检标本和酶标抗原或抗体与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的成分加入酶再作用底物催化显色，进行抗原/抗体的检测二、基本程序2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.11IndirectELISA2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.12SandwichELISA2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.13CompetitiveELISA2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.142020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.15分类方法1.按待测物种类分：测定抗原、半抗原和抗体。2.按酶标记物种类分：标记测定抗原、半抗原、第一抗体、第二抗体、葡萄球菌A蛋白（SPA）、生物素、亲和素、核酸等。2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.163.按反应性质分：竞争性和非竞争性。4.按是否将抗原或抗体结合到固相载体上分：固相酶免疫测定法、均相酶免疫测定法和双抗体酶免疫测定法。5.按与其它方法的结合使用分：免疫印迹技术、亲和素和生物素技术、放射免疫技术、PCR技术等。2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.171.固相载体和免疫吸附剂的制备最常用的固相载体是聚苯乙烯聚氯乙烯硝酸纤维素膜微孔滤膜三、ELISA方法的技术要点2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.18免疫吸附剂与固相载体结合的抗原或抗体称免疫吸附剂。包被（coating）将抗原或抗体固相化的过程称为包被。2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.192.抗原和抗体抗原要求纯度高，抗原性完整；抗体需特异、效价高、亲和力强，并具有较好的比活性。2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.20抗原和抗体最适工作浓度的选择在ELISA法中，包被蛋白液和酶标记的浓度应预先经过滴定进行选择，以期达到最适测定条件和节省试剂。2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.21酶标板用7.5%鞣酸室温处理1小时用缓冲液洗涤3～5次，3分钟/次加抗原/抗体包被，4℃过夜(或室温过夜)封闭液,封闭2小时四、ELISA常规流程2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.22洗涤酶标板3～5次，3分钟/次湿板或吹干后4℃保存洗涤酶标板3～5次，3分钟/次加样本100ul/孔，室温，1～1.5小时，振荡洗涤酶标板3～5次，3分钟/次2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.23加入酶标抗体，室温，1小时，振荡洗涤酶标板3～5次，3分钟/次加入底物，室温，避光，显色5～30分钟结果判读数据处理2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.24常用酶特性（1）纯度及比活性高，且价廉易得；（2）性质稳定，可溶性好；而且容易和抗体（或抗原）连接，二者的活性均不受影响；（3）受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物；（4）检测方法简易、敏感、精确；（5）酶的底物对人体健康无危害。五、常用酶类及其底物2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.25常用酶1.辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase，HRP）是目前酶联免疫检测方法中应用最为广泛的一种酶，该酶既可以标记抗原也可标记抗体。优点：a.标记方法简单；b.酶及酶标记物比较稳定，容易保存；c.溶解性好；d.价格较低，商品化酶易于获得；e.底物种类多，选择的余地大。2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.26常见底物1.辣根过氧化物酶底物过氧化物--过氧化氢供氢体—邻苯二胺（OPD），3、3’、5、5’-四甲基联苯胺（TMB），2，2氨基一二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸盐）（ABTS）等。2020年4月27日星期一©2009InvitrogenCorporation.AllRightsReserved.|ProprietaryandConfidential.27ABTS：2，2’-azino-di(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonate)2,2氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸盐）OPD：o-phenylenediamine邻苯二胺TMB：tetramethybenzidine四甲基联苯胺Luminol：3-氨基苯二甲酰肼（鲁米诺）BCIP：5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐NBT：nitrobluetetrazolium硝基兰四氮唑pNPP：p-nitrophenylphosphate对硝