SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成一稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式:非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE);非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂(SDS即十二烷基硫酸钠)后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(可以忽略电荷因素)。二、实验目的1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。2.掌握垂直板电泳的操作方法。3.运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。三、实验原理1.电泳带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。在一定的电场强度下，分子在凝胶介质中的迁移速率取决于分子的大小、构型和带电量的大小。2.PAGE聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和引发剂过硫酸铵(AP)的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。3.SDS-PAGE基本原理SDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：lgMW=K-bm将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。四、实验器材和材料试剂仪器:垂直板型电泳槽;直流稳压电源;50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽;烧杯;吸量管;常头滴管等。原料:低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5-1mgml-1样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。试剂:(1)分离胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液PH8.9):取1mol/L盐酸48mL，Tris36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL；(2)浓缩胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液PH6.7):取1mol/L盐酸48mL,Tris5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL；(3)30%分离胶贮液:配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺(Acr)30g及N，N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4保存；(4)10%浓缩胶贮液:称Acr10g及Bis0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存；(5)10%SDS溶液:SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解；(6)1%TEMED;(7)10%过硫酸铵(AP):现用现配；(8)电泳缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3):称取Tris6.0g,甘氨酸28.8g,SDS1.0g,用无离子水溶解后定容至1L；(9)样品溶解液:取SDS100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸水至10mL(遇液体样品浓度增加一倍配制)。用来溶解标准蛋白质及待测固体；(10)染色液:0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454mL50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可；(11)脱色液:75mL冰乙酸，875mL重蒸水与50mL甲醇混匀。五、实验操作1.制胶玻板的清洗用海绵和洗涤剂轻柔地清洗，严禁使用刷子和颗粒状的去污粉与洗衣粉，完全冲洗干净后烘干。2.垂直板电泳槽3.凝胶的制备①分离胶的制备配制12%分离胶。在烧杯中依次加入重蒸水3.35ml,分离胶缓冲液（1.5mol/LTris-HCl,pH8.8）2.5ml,10%SDS0.1ml,凝胶储备液4.0ml，10%过硫酸铵50ul和TEMED10ul。由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内，留出梳齿的齿高加1cm的空间停止灌胶，小心覆盖一层蒸馏水，37℃烘箱下聚合（约30min）。待分离胶聚合完全后，除去覆盖的蒸馏水。②浓缩胶的制备配制5%浓缩胶。在烧杯中依次加入重蒸水2.92ml,浓缩胶缓冲液(0.5mol/LTris-HCl,pH6.8)1.25ml,10%SDS0.05ml,凝胶储备液0.8ml，10%过硫酸铵25ul和TEMED10ul。由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内，灌满后小心插入梳齿，避免混入气泡，37℃烘箱下聚合（约30min）。4.蛋白质样品的处理①标准蛋白质样品的处理低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶BMW=97,400牛血清白蛋白MW=66,200牛碳酸酐酶MW=31,000胰蛋白酶抑制剂MW=20,100鸡蛋清溶菌酶MW=14,400开封后，沸水浴中加热3-5min后上样。②样液的准备用移液枪小心吸取处理好的血清50ul至1.5ml的离心管中，再加入50ul上样缓冲液，混匀后沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。5.加样用移液器分别取5l样品液，小心将样品加到凝胶凹形样品槽底部。6.电泳将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接，打开电泳仪开关，设置电压为200V，电泳60mins,此时溴酚蓝染料达到凝胶底部，停止电泳，关闭电源。7.染色与脱色电泳结束后，取下玻板，在自来水下用特制板撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入染色液染色60mins，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。8.结果处理量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR：𝐦𝐑=蛋白质样品迁移距离（𝐜𝐦）溴酚蓝区带距加样端距离（𝐜𝐦）六、实验结果及数据处理1.实验现象：脱色结束后，经观察可知，点有maker的孔跑出来的有5个清晰笔直的条带，迁移率由低到高排列这5个条带分别是分别是兔磷酸化酶B、牛血清白蛋白、牛碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制剂、鸡蛋清溶菌酶。点有血清蛋白的点样孔跑出的结果在分离胶与浓缩胶交界处出现一大团成分未知着色团，经老师讲解并且上网查阅资料得知这种现象可能是所谓的“鬼带”现象。“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀。出现这种现象主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法为：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。除此之外还观察到存在“拖尾现象”。这主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心;选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长，重新配制;降低凝胶浓度。2.实验数据处理：溴酚蓝区带距加样端距离：5.45cm待测样品迁移距离：5.18cm迁移距离（cm）2.182.783.124.035.09迁移率m0.400.510.570.740.93MW9740066200310002010014400lgMW4.994.824.494.304.16由公式：lgMW=K-bm可得：即：lgMW=5.5516-1.5867m当m=5.18/5.45=0.95时，lgMW=5.27，则：MW≈10965因此待测样品的相对分子质量约为10965。七、思考题1.在上样缓冲液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴酚蓝的作用分别是什么？答：SDS使蛋白质变性,用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳，也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸-蛋白复合物，在乳液聚合反应中，可充当两相溶液的乳化剂；巯基乙醇用于打开二硫键的，