第五节--菌种的衰退、复壮和保藏

菌种的衰退、复壮和保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；b）污染；c）死亡；一、菌种的衰退菌种的衰退（degeneration）：衰退的原因：是在细胞群体中发生的一系列生物学性状由量变到质变的逐步演变过程。大量群体中的自发突变菌种衰退的表现•对产量性状来说，菌种的负变就是衰退。•其他原有的典型性状变得不典型时，也是衰退。最易觉察到的是菌落和细胞形态的改变。•生长速度缓慢，产孢子越来越少。•代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降。•衰退还表现在抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱等。实践中关于防止菌种衰退•1．控制传代次数•2．创造良好的培养条件•3．用不易衰退的细胞传代利用不同类型的细胞进行接种传代。•4.采用有效的菌种保藏方法二、菌种的复壮1、狭义：指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，以达到该菌原有典型性状的一种措施。2、广义：广义的复壮是一项积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提高。实践中复壮方法•1．纯种分离。•2．通过宿主体内生长进行复壮。•3．淘汰已衰退的个体三、菌种的保藏在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本要求：原理：采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好时候它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼、生长受抑制的环境中。基本方法：生活态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥国际重要菌种保藏机构缩写名称ATCC美国标准菌种保藏所，美国马里兰州，罗克维尔市CBS真菌中心收藏所，荷兰，巴尔恩市NCTC国立标准菌种保藏所，英国，伦敦中国菌种保藏单位缩写名称缩写名称ACCC中国农业微生物菌种保藏管理中心ISF中国农业科学院土壤肥料研究所SH上海市农业科学院食用菌研究所CACC抗菌素菌种保藏管理中心IA中国医学科学院抗菌素研究所SIA四川抗菌素工业研究所CCGMC普通微生物菌种保藏管理中心AS中国科学院微生物研究所AS-IV中国科学院武汉病毒研究所CFCC林业微生物菌种保藏管理中心CAF中国林业科学院菌种保藏管理中心CICC工业微生物菌种保藏管理中心IFFI轻工业部食品发酵工业科学研究所CMCC医学微生物菌种保藏管理中心ID中国医学科学院皮肤病研究所NICPB卫生部药品生物制品监察所IV中国医学科学院病毒研究所CVCC兽医微生物菌种保藏管理中心CIVBP中国兽医药品监察所YM云南省微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会组织机构中国微生物菌种保藏管理委员会办事处(CCCCM):中国科学院微生物研究所内,北京(AS),1000801.普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)中国科学院微生物研究所,北京(AS),100080:真菌、细菌中国科学院武汉病毒研究所,武汉(AS-IV),430071:病毒2.农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)中国农业科学院土壤肥料研究所,北京(ISF),1000813.工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)轻工业部食品发酵工业科学研究所,北京(IFFI),1000274.医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)中国医学科学院皮肤病研究所,南京(ID),210042:真菌中国药品生物制品检定所,北京(NICPBP),100050:细菌中国医学科学院病毒研究所,北京(IV),100052:病毒5.抗菌素菌种保藏管理中心(CACC)中国医学科学院抗菌素研究所,北京(IA),100050四川抗菌素工业研究所,成都(SIA),610051:新抗菌素菌种华北制药厂抗菌素研究所,石家庄(IANP),050015:生产用抗菌素菌种6.兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)农业部兽医药品监察所,北京(CIVBP),1000817.林业微生物菌种保藏管理中心(CFCC)中国林业科学院,北京(CAF),100091工业微生物菌种保藏技术•(1)超低温或在液氮中冷冻保藏；•(2)冷冻干燥或真空干燥保藏；•(3)转接培养或斜面传代保藏；•(4)土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。菌种保藏方法暂时保藏法斜面传代法穿刺法长期保藏法液体石蜡法甘油管法砂管保藏法砂土管保藏法滤纸片保藏法冷冻干燥保藏法液氮冷冻法冷冻保藏•冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。•通过冷冻，使微生物代谢活动停止。加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速度。•冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。一、普通冷冻保藏技术(-20℃)二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)三、液氮冷冻保藏技术•方法普通冷冻保藏技术(-20℃)•将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。•用此方法可以维持微生物的活力1—2年。•应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。•保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。•这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)•要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进行保藏。•在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。液氮冷冻保藏技术(一)冷冻保护剂在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤1．待冷冻保藏菌种悬液的制备2．控速冷冻(三)复苏迅速将安瓿置于37-40℃水浴中，并轻轻摇动以加速解；用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml(约4、8滴)转接入琼脂斜面上。致冷速度为1℃/min从生长斜面制备菌悬液从液体培养制备菌悬液冻干保藏基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。培养物的冻干过程配制保护剂灭菌菌种培养制备菌悬液分装安培瓶洗净烘干装标签加棉塞预冻真空干燥测定水分熔封管口检查真空度保藏安培瓶冷冻真空干燥操作流程传代保藏•将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。•可用于实验室中若干菌种的保藏。•此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。•但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。操作方法1、斜面保藏法将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C˚冰箱中包藏。保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。2、液体石蜡保藏法将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1CM为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存。此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通细菌也可保藏1年左右。3、穿刺保藏法按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后用胶塞封严，置4℃冰箱存放。载体法原理：使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。操作方法（砂土管保藏法）（1）河砂处理取河砂若干加入盐酸10%，加热煮沸30min除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。（２）土壤处理取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。(3)砂土混合处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或根据需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均匀后，装入10x100mm的小试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌(通常采用间歇灭菌2--3次)，最后烘干。（4）将要保存的斜面菌种制成浓细胞悬液(≥106/ml)，用灭菌滴管或吸管吸取孢子悬液滴入无菌沙土上，每管约0.3～0.5ml，用接种环将其混合均匀。也可将真菌分生孢子用接种环从斜面直接挑取放入沙土中。（5）然后将沙土管抽真空干燥。这时管内砂土松散，表明已干燥。将干燥的砂土管放置在干燥器或密闭容器内、干燥器下部放置变色硅胶等干燥剂，于4℃下保存。从斜面取出的孢子放入沙土管中混匀后，可以不抽真空直接放干燥器内保存。由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。参考书•李钟庆编著微生物菌种保藏技术科学出版社1989•中国科学院微生物研究所著菌种保藏手册科学出版社1980.2