生物检定法

主要内容第一节概述第二节生物检定质反应的直接测定法第四节生物检定法的应用第三节生物检定量反应的平行线测定法第一节概述五.生物检定的常用方法二.生物检定的应用范围三.标准品四.生物检定中的基本概念一.生物检定法简介六.生物检定的步骤七.生物统计知识一生物检定法简介1.什么是生物检定法？待检药物被测物的相对效力（效价或毒性）有效性安全性生物体标准品活性反应动物组织细胞微生物相对快速、重复性好、不能反映药品的生物特异性和有效性反映药品的生物特异性和有效性繁琐、误差大2.生物检定采用的实验方法定量、半定量、定性药品的生物效价、安全检查、鉴别体外测定(invitro)离体器官、组织,微生物,酶和细胞体内测定(invivo)整体动物类别3.生物检定法特点以药理学反应为基础(定量药理学—剂量和反应的函数关系)以标准品对比校验为手段（在产生特定反应情况下，以供试品与标准品剂量比值推算供试品效价）以生物统计学方法为结果判断的依据真正的活性测定，与理化分析、蛋白结合试验不同；但生物差异性大（实验误差大）、专业性强、实验周期长，人力、物力消耗大，计算较繁。控制生物差异性的方法与措施:生物来源、饲养或培养条件必须均一。采用特定的实验设计,对影响实验误差的条件和因子进行限制,减少实验误差。用生物统计方法提高实验的可靠性。4.生物检定的必要性理化方法不能反应其活性。为理化分析的补充多组分生物药物无适当理化方法进行检定；多组分、组分不明确、组成不定、结构不清楚的药物抗生素、细胞因子类、血液制品、疫苗、酶(含异构体)、多肽激素(含异构体)。肝素天青A显色比色法测定×（但变性的肝素同时显色，不能反应肝素活性）所以:肝素抗凝血活性√应用范围342药物效价测定1微量生理活性物质测定某些有害杂质限度检查中药质量控制二生物检定法的应用范围多组分生化药物制剂、激素类药物、生物制品:由结构类似、而生物活性不同、比例不定的多种成份组成，或其组分不明确、结构复杂，难用理化方法反映其生物活性；虽可用理化方法测定含量，但含量不能完全反映效价（生物检定是反映产品质量的重要指标，具有专属性。当前英国、美国及中国药典都有收载）药物效价测定生化药物肝素、胰岛素、缩宫素、绒促性素、硫酸鱼精蛋白、精蛋白锌胰岛素、卵泡刺激素、黄体生成素、降钙素、生长激素、升压素等21个品种（约占我国生化药的10%）抗生素生物制品菌苗、疫苗、抗毒素、类毒素等药典生物药物效价测定品种:应用范围342药物效价测定1微量生理活性物质测定某些有害杂质限度检查中药质量控制二生物检定法的应用范围无菌、微生物限度、热原、细菌内毒素、异常毒性、降压物质、过敏等药典几百种有害杂质限度检查应用范围342药物效价测定1微量生理活性物质测定某些有害杂质限度检查中药质量控制二生物检定法的应用范围一些神经介质，激素等微量生理活性物质，由于其很强的生理活性，在体内的浓度很低，加上体液中各种物质的干扰，很难用理化方法测定。而不少活性物质的生物测定法由于灵敏度高、专一性强，对供试品稍作处理即可直接测定。如乙酰胆碱，5-羟色胺等活性物质的测定。微量生理活性物质测定应用范围342药物效价测定1微量生理活性物质测定某些有害杂质限度检查中药质量控制二生物检定法的应用范围中药成份复杂，大部分中药的有效成份尚未搞清，难以用理化方法加以控制，但可用一些以其疗效为基础的生物测定方法来控制其质量。中药质量控制三标准品与供试品及其表示标准品（S）：系指用于生物检定中效价测定的标准物质，以效价单位(U)表示。PS表示S的效价国家标准品：系指用国际标准品标定的用于定量测定某一制品效价或毒性的标准物质，其生物活性以国际单位（IU）或以单位（U）表示。供试品（T）供试品(T)是供检定其效价的样品,它的活性成分应与标准品基本相同。AT是T的标示量或估计效价PT是经检定的T的效价,称“测得效价”效价是表达药物效力强弱或活性物质含量的一种公认的剂量单位。效价单位（U）是衡量生物药物有效成分效力的具体尺度。效价:用每毫升或每毫克中含有某种生物药物的效价单位数表示药物效力或浓度单位U/mg，U/mL例如:青霉素钠的效价为1670U/mg庆大霉素的效价为590U/mg洋地黄的效价为10U/mL效价单位(效应浓度单位)（一）生物反应（生物检定的基础）（二）剂量与反应的关系（三）等反应对比检定四.效价检定中的基本概念（一）生物反应（生物检定的基础）药物生物学定量法胰岛素小鼠血糖降低法小鼠惊厥法肝素家兔血凝时间法抗生物微生物生长抑制法生物制品动物保护力活菌数和活病毒滴度生长激素去垂体大白鼠体重法（二）剂量与反应的关系生物反应类型质反应：给药后,观察某一反应的某一程度出现与否。如是否死亡、是否惊厥，是质的变化，称质反应。量反应：药物对生物体所引起的反应随着药物剂量的增加产生的量变可以测量者,称量反应。如血压、血凝时间、血糖等。剂量与反应的关系某降压药：剂量降压作用1μg15mmHg2μg25mmHg3μg30mmHg剂量与反应间一般呈曲线关系剂量与反应关系的直线化剂量与反应间一般呈曲线关系将剂量取对数(lgd)后可与反应(y)成直线关系生物检定中的剂量常用对数表示将药物的供试品（T）和已知效价的标准品（S）对生物体进行同时对比，以对T的效价（或毒力）进行检定的方法。属于对比检定。（三）等反应对比检定**（相对效力的计算）S—dS（标准品剂量）；PS（标准品效价）T—dT（供试品剂量）；PT（供试品效价）常以产生等反应时的效价比值R得出R=PT/PS对于量反应：S和T各自的对数剂量和反应应呈直线关系S和T的两条直线应平行等反应对比检定原理lgdS=XSlgdT=XTM=lgdS-lgdT=XS-XTS与T等反应时所对应剂量分别为：等反应时:S和T中所含效价应相等，即：dT·PT=dS·PS（S和T中所含效价单位数）令：R=PT/PS=dS/dT（1）∴PT=R·PS（2）求出R就可以求出PT（R为等反应效价的比值）（1）式两边取对数，lgR=lgPT/PS=lg(dS/dT)=lgdS-lgdT令lgR=M,lgd=X,则对数效价比值：lgR=M=lgdS-lgdT=XS-XTR=lg-1M=lg-1(XS-XT)PT==R·PS=lg-1M·PS实际工作中S的剂量常按已知效价计算，而T的剂量按标示效价或估计效价（AT）来安排:PT=R·ATR=PT/PS=dS/dT（1）五生物检定的常用方法(一)质反应的直接测定(二)量反应平行线测定法六生物检定的步骤实验设计的选择反应指标的测定实验可靠性检验(方差分析)相对效力的计算及可信限的估计学习要求特定的实验设计-常用对称定型实验设计→看懂生物统计方法-常用定型公式或简算法计算→弄懂基本道理;会套用七.生物统计知识（实验设计及方差分析）（四）实验可靠性检验（方差分析)（一）实验设计的目的（二）试验设计重要三原則（三）生物检定常用实验设计一.实验设计的目的最少的代价获得最多的信息可有效排除混杂变异对结果的影响便于采用简化计算(采用定型对称设计有利于有效性检验的简化)采用特殊实验设计(提高精度和灵敏度)标准曲线法与量反应平行线4.4法测定LMWH产品抗FXa效价比较标准曲线法结果误差大,重现性差,波动大,缺乏可比性；当采用量反应平行线原理的4·4实验设计,结合生物统计,其结果较平稳,误差小,重现性好。二.试验设计重要三原則重复随机对照如：试验某种降压药物的降压作用：将20只雄性大鼠随机分成两组，每组10只，一组作为空白对照，一组给予待测药物。完全随机化设计随机区组设计交叉实验设计三.生物检定常用实验设计1完全随机化设计动物号12345678910随机号1203874596组别甲乙乙甲乙甲乙甲甲乙将10个观察对象随机分为两组：例：洋地黄效价测定——鸽最小致死量(MLD)法单号为甲组，双号为乙组2随机区组设计将分成8各区组（如来自8个窝的动物）的32个受试者随机分配到A,B,C,D四个处理组各区组中的受试者被随机分配接受的不同处理区组处理ABCD一1432二5687三1091211四16141315五19181720六23222124七28272625八30312932例：催产素生物检定法——大鼠子宫法动物编号1234第一次STST第二次TSTS3.交叉实验设计S为标准品组，T为供试品组平衡实验次序的影响。把不同因素不同水平均摊于受试对象，去除试验时间次序和试验次序的影响例:小鼠血糖法测定胰岛素效价处理在同一受试对象上重复观察，由于处理是在同体上比较，从而避免了个体差异。四方差分析(F检验)1.方差分析的概念用于推断多个总体均数有无差异(差异显著性)的检验方法如：观察四种降压药对大鼠的降压效果或观察四个剂量的降压药对大鼠的降压效果2.方差S2：是测量值在其总体均值周围分布状况的一种量度，方差表征随机变量分布的离散程度。方差S2==f=n-1自由度离均差∑(yi-)2fSSf方差S2==f=n-1fSSf方差S2==差方和SSf=n-1fSSf方差S2==f=n-1fSSf方差S2==f=n-1fSSf方差S2==f=n-1fSSf组间变异总变异组内变异组间变异（处理效应）用组间方差表示；组内变异（随机误差）用组内方差表示。3.方差分析原理S2总=S2处理+S2误差s2总=s2处理+s2误差4方差和F值计算方法SS总=SS处理+SS误差f总=f处理+f误差SS误差=SS总－SS处理f误差=f总－f处理s2总=SS总/f总；s2处理=SS处理/f处理s2误差=SS误差/f误差误差项S2F值=处理效应方差S2SS处理fSS误差f=方差分析（F检验）:以处理组方差(S2)与误差项方差（S2（误差））的比值（称F值）来确定处理效应差异的显著性程度。查F值表，当F计算值大于P＝0.05或P＝0.01的查表值时，则P＜0.05或P＜0.01，即为在此概率水平下该项变异有显著意义。5.方差分析(F检验)的步骤建立检验假设：无效假设把处理间的方差μ12与误差的方差假设相等即：H0：μ12=μ22；备择假设HA：μ12≠μ22计算各处理组的方差及组内的方差，求出相应的F值。计算所得的F值与F表中按一定自由度查得的F0.05或F0.01进行比较若处理组F＞F0.05（F0.01）则拒绝H0，接受HA，认为该处理所引起的差异有显著（极显著）意义。若处理组F＜F0.05则接受H0，认为该处理所引起的差异无显著意义。第二节质反应的直接测定一.测定程序将实验对象随机分成两组，S组与T组，分别测定两组的MED（最小效量）——y值计算出M、R和PT估计实验误差（用可信限（FL）表示）以产生质反应的最低效量(MED)为反应指标（y）按公式计算出M，再求算R和PT：R=lg-1MPT=R·AT二.M和PT的计算R=PT/PS=dS/dT误差项方差S2的计算三.实验误差的估计（用可信限（FL）表示）步骤：标准误SM的计算可信限（FL）的计算1.误差项方差S2的计算S2=(∑XS2－)+(∑XT2－）(∑XS)2nS(∑XT)2nTnS+nT-2nS、nT为标准品和供试品的反应个数2.标准误SM的计算是指平均数的标准差,即各均数之间差异的大小,用SM表示,SM越小差异也越小。S2为误差项方差nS、nT分别为标准品和供试品的反应个数用SM对总体均数进行评估，计算可信限。标志检定(R和PT)结果的精确度R的FL=lg-1(M±t·SM)PT的FL=AT·lg-1(M±t·SM)t(f,0.05)：根据f和概率水平查表获得R或PT高限-R或PT低限2R或2PT3可信限（FL）的计算R或PT的FL%=×100%除药典另有规定外，可信限率不得大于5%。4.示例:质反应直接测定法洋地黄效价的测定——鸽最小致死量（MLD）法本法系比较洋地黄标准品(S)与供试品(T)对鸽的最小致死量(MLD，U/kg)，以测定供试品的效价。实验方法：标准品稀释液的配制标准品溶液(S)0.9％氯化钠1→30稀释(