植物叶绿体色素含量的测定(沈)(精)

植物叶绿体色素含量的测定福建农林大学生命科学学院植物生理生化实验室2、为什么要测定完全液和缺素苗的叶绿色素含量？1、为什么要测定叶绿色素？叶绿体色素在光合作用中起到吸收光能、传递光能的作用.因此，叶绿体色素的含量与植物的光合速率密切相关。在一定范围内，光合速率随叶绿体色素含量的增加而升高。另外，叶绿体色素的含量是植物生长状态的一个反映，一些环境因素如元素缺乏、干旱、盐渍、低温等都可以影响叶绿体色素的含量与组成，并因之影响植物的光合速率。一、实验目的二、实验原理叶绿素a：吡咯环Ⅱ-CH3叶绿素b：吡咯环Ⅱ-CHO叶黄素：3,3’-OH胡罗卜素：3,3’-HMg2+叶绿体色素组成叶绿素是双羧酸的酯，一个羧基被甲醇所酯化，另一个羧基被叶绿醇所酯化。叶绿素a与b的不同之处是叶绿素a比b多两个氢少一个氧。两者结构上的差别仅在于叶绿素a的第Ⅱ吡咯环上一个甲基(－CH3)被醛基(－CHO)所取代。叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇(植醇)的“尾巴”。高等植物叶绿体色素叶绿素类胡萝卜叶黄素---C40H56O胡萝卜素---C40H56叶绿素b---C55H70O6N4Mg叶绿素a---C55H72O5N4Mg这两类色素均不溶于水，而溶于含有水的有机溶剂，故常用95％的酒精和80％丙酮提取，叶绿体色素易受光氧化，提取色素应在弱光中进行，并避光保存色素叶绿素吸收光谱：最大吸收区域在蓝紫光部分（400-500nm），基本上不吸收黄光，从而呈现黄色。类胡萝卜素吸收光谱：叶绿体色素提取液中各色素的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离的情况下同时测定叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的浓度，可分别测定在663nm、645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）和475nm的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的浓度。•A663=82.04Ca+9.27Cb（1）•A645=16.75Ca+45.60Cb（2）•公式中Ca为叶绿素a的浓度，Cb为叶绿素b浓度（单位为g/L），82.04和9.27分别是叶绿素a和叶绿素b在663nm下的比吸收系数（浓度为1g/L，光路宽度为1cm时的吸光度值）；16.75和45.60分别是叶绿素a和叶绿素b在645nm下的比吸收系数。即混合液在某一波长下的光吸收等于各组分在此波长下的光吸收之和将上式整理，可以得到下式：Ca=0.0127A663-0.00269A645（3）Cb=0.0229A645-0.00468A663（4）将叶绿素的浓度改为mg/L，则上式变为：Ca=12.7A663-2.69A645（5）Cb=22.9A645-4.68A663（6）CT=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645（7）CT为叶绿素的总浓度三、实验仪器及材料•实验材料：–缺素营养液及完全营养液培养的玉米苗叶片•实验仪器及试剂：–S22分光光度计；研钵；移液管；漏斗；滤纸；95%乙醇；石英砂；CaCO3叶绿体色素是一种酯，因此不溶于水。通常用含有少量水的有机溶剂如80％的丙酮，或者95%乙醇的混合液来提取叶片中的叶绿体色素，用于测定叶绿体色素含量。之所以要用含有水的有机溶剂提取叶绿体色素，这是因为叶绿体色素与蛋白质结合牢，需要经过水解作用才能被提取出来。1.叶绿体色素的提取提取方法研磨法浸提法四、实验步骤研磨法提取光合色素少许石英砂、碳酸钙和1ml95%乙醇研磨至组织发白完全转移定容至25ml2.测量光吸收利用S22分光光度计分别测定叶绿体色素提取液在470nm、649nm和665nm下的吸光度五、结果计算与分析1.结果计算C(mg/L)×提取液总量（L）×稀释倍数Chl=(mg/g鲜重)材料鲜重（g）*10002.比较分析不同营养处理的植物叶绿素含量差异及其Chla/Chlb差异•实验要点：•1、研磨要在弱光下进行，且速度要快；•2、研磨时要加入少量的碳酸钙，保护叶绿素；•3、残渣中的色素要充分洗脱；•4、波长要调准；•5、比色液不能混浊。六、思考题•1、叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素ａ、ｂ的定量分析？为什么？•2、为什么提取叶绿素时干材料一定要用80％的丙酮或乙醇，而新鲜的材料可以用无水丙酮或乙醇提取？