酶的质量标准研究指导原则

酶的质量标准研究指导原则陈钢（上海市食品药品检验所）酶是由生物细胞产生的，受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。本指导原则主要是对蛋白质多肽类酶的质量标准研究进行讨论。一、酶通论人们对酶的认识主要是从酒的发酵（葡萄糖－→乙醇+CO2）开始。1857年微生物学家Pasteur等人提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果，但Büchner发现不含细胞的酵母提取液也能使糖发酵。1878年Kühne提出了Enzyme（酶）这个名称，这个字来自希腊文，意思是“在酵母中”。1913年Michaelis和Menten提出酶促动力学原理－－米氏学说。1926年Sumner第一次从刀豆中提取出了脲酶结晶。证明其具有蛋白质性质。上世纪80年代初Cech和Altman分别发现了具有催化功能的RNA——核酶（ribozyme），这一发现打破了酶是蛋白质的传统观念，开辟了酶学研究的新领域。到目前为止，已鉴定出4000多种酶，数百种酶已得到结晶，而且每年都有新酶发现。酶作为生物催化剂具有显著地改变化学反应速率，使之加快达到平衡，但不能改变反应的平衡常数。酶比一般催化剂能更显著地降低活化能，催化效率更高（见下图）。图1.催化过程与非催化过程自由能的变化1、酶的化学本质和化学组成酶的化学本质除具有催化活性的RNA外几乎都是蛋白质，这主要是：（1）酶经酸碱水解后的终产物是氨基酸；（2）酶是具有空间结构的生物大分子，凡使蛋白质变性的因素都可使酶变性失活；（3）酶是两性电解质，在不同pH下呈现不同的离子状态，在电场中向某一电极泳动，各自具有特定的等电点；（4）酶和蛋白质一样，具有不能通过半透膜等胶体性质；（5）酶也有蛋白质所具有的化学呈色反应。另外，酶的催化活性依赖于它们天然蛋白质构象的完整性，假若一种酶被变性或解离成亚基就会失活。从化学组成来看酶可分为简单蛋白质和结合蛋白质两类。简单蛋白质的酶类的活性仅决定于其蛋白质结构，该类酶不含其它物质。如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及核糖核酸酶等。结合蛋白质的酶类，除了蛋白质外，还要结合一些对热稳定的非蛋白质小分子物质或金属离子才能表现出酶的活性，前者称为酶蛋白（决定酶反应的专一性），后者称为辅助因子（对电子或化学基团起传递作用），两者结合称为全酶。根据结合的程度，可将辅助因子分成辅酶和辅基。通常辅酶是指与酶蛋白结合比较松弛的小分子有机化合物，通过透析方法可以除去，如辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ等。辅基是以共价键与酶蛋白结合，不能通过透析除去，需要经过一定的化学处理才能与蛋白质分开，如细胞色素氧化酶中的铁卟啉。另外，根据酶蛋白分子的特点又可将酶分成单体酶（由一条肽链组成）、寡聚酶（由两个或两个以上亚基组成）和多酶复合体（由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成）。2、酶的命名和分类1961年国际生物化学学会酶学委员会推荐了一套新的系统命名方案及分类方法，已被国际生物化学学会接受。规定每一种酶应有一个系统名称和一个习惯名称。（1）习惯命名法1961年以前使用的酶的名称都是习惯沿用的，称为习惯名。主要依据两个原则，其一是根据酶作用的底物命名，如催化水解淀粉的酶叫淀粉酶。有时还加上来源以区别不同来源的同一类酶，如胃蛋白酶，胰蛋白酶。其二是根据酶催化反应的性质及类型命名，如水解酶、转移酶、氧化酶等。有的酶结合上述两个原则来命名，如琥珀酸脱氢酶。（2）国际系统命名法其原则是以酶所催化的整体反应为基础的，规定每种酶的名称应当明确标明酶的底物及催化反应的性质。如果一种酶催化两个底物起反应，应在它们的系统名称中包括两种底物的名称，并以“：”号将它们隔开。若底物之一是水，可将水略去不写，举例见下表。表1.酶国际系统命名法举例习惯名称系统名称催化反应乙醇脱氢酶乙醇：NAD+氧化还原酶乙醇+NAD+→乙醛+NADH谷丙转氨酶丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶丙氨酸+α-酮戊二酸→谷氨酸+丙酮酸脂肪酶脂肪：水解酶脂肪+H2O→脂肪酸+甘油（3）国际系统分类法及酶的编号国际酶学委员会根据各种酶所催化反应的类型，把酶分为6大类，即氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。每一个酶的分类编号由4个数字组成，数字间由“.”隔开。第一个数字指明该酶属于6个大类中的哪一类；第二个数字指出该酶属于哪个亚类；第三个数字指出该酶属于哪个亚亚类；第四个数字则表明该酶在亚亚类中的排号。编号之前冠以EC（为EnzymeCommision的缩写）。如：EC1.1.1.1表示氧化还原酶，作用于CHOH基团，受体是NAD+或NADP+，列第1位的酶叫“醇：NAD+氧化还原酶”。一切新发现的酶，都能按此系统得到适当的编号，从酶的编号可了解到该酶的类型和反应性质。每个编号的含义可至欧洲生物信息研究所的网站查询表2.中国药典收载的酶的编号中文名英文名EC编号*门冬酰胺酶asparaginase3.5.1.1尿激酶urokinase3.4.21.73玻璃酸酶hyaluronidase3.2.1.35胃蛋白酶pepsin3.4.4.1胰激肽原酶pancreatickininogenase3.4.21.35胰蛋白酶trypsin3.4.4.4胰淀粉酶amylopsin3.2.1.1胰脂肪酶pancrelipase3.1.1.3凝血酶thrombin3.4.4.13糜蛋白酶chymotrypsin3.4.4.5*注：酶的EC编号可至TheComprehensiveEnzymeInformationSystem网站查询。3、酶促反应动力学酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学。它是以化学动力学为基础，讨论底物浓度、抑制剂、pH、温度及激活剂等因素对酶反应速率的影响。化学动力学中在研究化学反应速率与反应物浓度的关系时，常分为一级反应、二级反应和零级反应。研究证明，酶催化过程的第一步是生成酶（E）-底物（S）中间产物（ES），Michaelis-Menten根据中间产物学说的理论推导出酶反应动力学方程式，即米氏方程。ν=Vmax∙[S]Ks+[S]（1）式中ν为反应速率，Vmax为酶完全被底物饱和时的最大反应速率，[S]为底物浓度，Ks为ES的解离常数。而后经Briggs和Haldane以稳态理论加以修正，得下式。v=Vmax∙[S]Km+[S]（2）式中Ｋｍ称为米氏常数，（１）和（2）均称为米氏方程。米氏方程曲线见图２。从米氏方程可得到几个重要的物理常数，即Km、Vmax、kcat、kcat/Km。米氏常数Km是酶的一个特征常数，其物理含义是当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度（见图2），以mol/L为单位。米氏常数的意义：（1）Km大小只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关，对某一酶促反应而言，在一定条件下都有特定的Km值，可用来鉴别酶。（2）Km值可以判断酶的专一性和天然底物，有的酶可作用于几种底物，因此就有几个Km值，其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物也就是天然底物。（3）若已知某个酶的Km值，就可以计算出在反应速率相当于Vmax的某百分率时，某底物的浓度[S]。一般来说反应速率达到Vmax时，[S]约为1000Km。这时酶全部被底物所饱和，ν与[S]无关，符合零级动力学，只有在此条件下才能正确测得酶活力。图２．米氏方程曲线最大反应速率Vmax与Km相似，在一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一个常数，同一种酶对不同底物的Vmax也不同，pH、温度和离子强度等因素也影响Vmax的数值。通过测定不同底物浓度的反应初速度，用双倒数等作图法，可以得到Km和Vmax。kcat称为催化常数（catalyticconstant），又叫转换数（TN值），它的单位为ｓ－１，kcat值越大，表示酶的催化速率越高。kcat／Km常用来比较酶催化效率的参数。4、酶的抑制作用酶促反应速率常受抑制剂影响，根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，将抑制作用分为可逆抑制作用和不可逆抑制作用。根据可逆抑制剂与底物的关系分为竞争性抑制、非竞争性抑制及反竞争性抑制三类，可以分别推导出抑制作用的动力学方程。竞争性抑制可以通过增加底物浓度而解除，其动力学常数K’m变大，Vmax不变；非竞争性抑制Km不变，V’max变小；反竞争性抑制K’m及V’max均变小。通过动力学作图可以区分这三类可逆抑制作用。可逆抑制剂中最重要的是竞争性抑制剂，过渡态底物类似物为强有力的竞争性抑制剂。不可逆抑制剂中，最有意义的为专一性Ks型及kcat型不可逆抑制剂。研究酶促反应动力学和酶的抑制作用是研究酶的结构与功能、酶的催化机制、阐明代谢途径以及设计新药物的重要手段。一般新发现的酶或要证明所获得的酶结构均要进行酶促反应动力学和酶的抑制作用的研究。这也是为什么要花一定的篇幅进行酶通论的讨论。另外，温度、pH和激活剂都会对酶促反应速率产生重要影响，酶反应有最适温度和最适pH，要选择合适的激活剂。在研究酶促反应速率和酶的活力时，都应选择酶的最适反应条件。二、酶的制法要求生物细胞产生的酶有两类，一类由细胞内产生然后分泌到细胞外进行作用的酶，称为胞外酶，这类酶大都是水解酶类。另一类酶在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而是在细胞内起催化作用的称为胞内酶，这类酶数量较多。一般而言，胞外酶比胞内酶更易于分离纯化。根据酶的特点在分离纯化中应注意以下几点：（1）选材应选择酶含量丰富的新鲜生物材料，酶的提取工作应在获得材料后立即进行，否则应在-20~-70℃下保存或将生物材料制成丙酮粉保存；（2）破碎动物组织细胞较易破碎，通过一般的研磨器、匀浆器、高速组织捣碎机就可达到目的。微生物及植物细胞壁较厚，需要用超声波、细菌磨、冻融、溶菌酶或用某些化学溶剂如甲苯、去氧胆酸钠、去垢剂等处理加以破碎，制成组织匀浆。（3）抽提在低温下，以水或低盐缓冲液，从组织匀浆中抽提酶，得到酶的粗提液。（4）分离和纯化酶是生物活性物质，在分离纯化时必须注意尽量减少酶活性损失，操作条件要温和，全部操作一般在0~5℃进行。根据酶大多属于蛋白质这一特性，用一系列分离蛋白质的方法，如盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级、选择性热变性等方法可从酶粗提液中初步分离酶。然后再采用层析和制备电泳技术进一步纯化酶，以得到纯的酶制品。在制备对金属离子敏感的酶时，在提取液中可加入少量金属螯合剂（EDTA）以防止金属离子对酶的破坏作用；制备含巯基的酶时，可加入某种巯基试剂（DTT）以防止酶的巯基在制备过程中被氧化；为防止内源性蛋白酶对酶的水解作用，可在提取液中加入少量的蛋白酶抑制剂，如甲苯磺酰氟、亮抑酶肽（leupeptin）、抑酶肽（aprotinin）等。（5）保存通常将纯化的酶溶液经透析除盐后冷冻干燥得到酶粉，低温下可较长时间保存。应注意酶溶液浓度越低越易变性，因此不能将酶保存在稀溶液中。由于酶制品均来自生物细胞，根据2010年版中国药典（二部）凡例中第十四款“制法项下主要记载药品的重要工艺要求和质量管理要求”的规定，酶的质量标准中应制订【制法要求】，特别是供注射用的酶原料。具体要求如下：（1）所有药品的生产工艺应经验证，并经国务院药品监督管理部门批准，生产过程均应符合《药品生产质量管理规范》的要求。（2）直接用于生产的菌种、毒种、来自人和动物的细胞、DNA重组工程菌及工程细胞，来源途径应经国务院药品监督管理部门批准并应符合国家有关的管理规定。（3）来源于动物组织提取的药品，其所用动物种属要明确，所用脏器均应来自经检疫的健康动物，涉及牛源的应取自无牛海绵状脑病地区的健康牛群；来源于人尿提取的药品，均应取自健康人群。上述药品均应有明确病毒灭活工艺要求以及质量管理要求。根据上述要求，在制订酶制品的质量标准时，首先应根据工艺对动物、脏器、粗制品和中间体等进行质量规范，必要时可用附件附在质量标准后；其次每批所投的酶原料的来源种属要明确，不能混种投料，因此质量标准中应有种属鉴别的要求，至少也应在粗制品以前阶段的质量规范中要