稳定转染细胞系的一般建立方法

转染克隆的G418筛选和分离对于需要建立某些基因已经整合到染色体DNA（通过稳定或永久转染）的细胞系来说，理想的是使用选择标记，通常也是必要的。虽然有许多标记可利用，但G418(氨基糖苷类抗生素)为稳定转染试验提供了一种通用方便的选择。G418是一种氨基糖苷类似物，在结构上与新霉素、庆大霉素和卡那霉素相似，它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。因此在哺乳动物细胞中表达细菌APH（氨基糖苷类磷酸转移酶）基因将产生G418的解毒作用。这一程序提供了建立G418选择条件的一般性指导，特殊条件由研究者个人决定。1.建立死亡曲线，确定最佳筛选浓度（参考建立方法见附录）；2.细胞铺板：转染后24小时将贴壁的细胞传代（传代时，注意通过在显微镜下观察，控制细胞密度，不能使细胞太密集，应该少于生长表面的50%，参考为20%-30%）至15cm培养皿，加入15~20ml培养基（DMEM，含血清）进行培养；3.用最佳筛选浓度的G418对细胞进行筛选：铺板完成后，再过24小时，抗性表达，用最佳筛选浓度的G418进行筛选（对于Hela细胞，一般筛选终浓度为800ug/ml）。具体操作是去除旧的培养基，用PBS洗一次，将含有浓度为800ug/ml（以Hela为例）的培养基15~20ml加入培养皿内即可；4.换液：每日及时观察细胞，根据培养基的颜色和细胞生长情况，及时更换相同浓度（800ug/ml）的培养基，大概持续筛选一周左右，直至空白对照组（未转染组）细胞死亡大部分（至少30%以上）；5.撤药维持阶段：待空白组细胞大部分死亡后，将实验组（转染组）进行换液，此时所用培养基含G418的终浓度为200ug/ml（维持浓度），维持生长（若细胞仍有死亡，需要继续降低药的浓度，参考为50-100ug/ml），直至筛选克隆可见为止（大约2~3天）；6.分离克隆以获得最大数量细胞（提高克隆成活可能性），减少单个克隆受其他细胞污染的机会。具体操作是：a.用PBS洗含有克隆的培养物，圈出欲分离的克隆。从培养皿中除去液体，准备24孔板收集克隆；b.从培养皿中用牙签或者棉棒（经过高压）挑取已分离出的克隆（具体操作是先用棉棒蘸一下胰酶，再蘸一下克隆）；c.在24孔板的一个孔中（事先已加入完全培养基，不含G418）剧烈摇动牙签，使细胞沉于孔中，继续挑取下一个克隆；7.CO2孵箱，温育细胞约两小时；8.两小时后，镜检培养皿，确定细胞是否附着。如果已经附着，用新鲜完全培养基（含50ug/mlG418）更换24孔板培养基，除去残留的胰蛋白酶，继续培养直到培养物长满；9.一旦小量培养物长满，转接到大的培养皿（通常先是6孔板），用50ug/ml的新鲜完全培养基维持培养，然后与同样类型的其他细胞一样处理即可。附录：死亡曲线建立方法1.G418的配制：取G418共1g溶于1mol/L的HEPES溶液1ml中，加蒸馏水至10ml，过滤除菌，4℃保存；2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6h左右开始加药；3.制备筛选培养基：在100~1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100、400、800、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基；4.加G418筛选：吸除培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基；5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每隔3~5d更换一次筛选培养基；确定最佳筛选浓度：在筛选10~14d内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。初夏早上六点，清亮透明的月儿还躲藏在云朵里，不忍离去，校园内行人稀少，我骑着单车，晃晃悠悠的耷拉着星松的睡眼。校园内景色如常，照样是绿意盈盈，枝繁叶茂，鸟儿歌唱。经过西区公园，看那碧绿的草地，飞翔中的亭子，便想起十七那年，在这里寻找春天的日子。本想就此停车再感受一遍，可惜心中记挂北区的荷塘。回想起冬日清理完荷塘的枯枝败叶，一片萧条的景色：湖水变成墨绿色，没有鱼儿游动，四处不见了鸟儿的踪影，只有莲藕躺在湖底沉沉睡去。清洁大叔撑着竹竿，乘一叶扁舟，把一片片黑色腐烂的枯叶残枝挑上船。几个小孩用长长的铁钩把莲蓬勾上岸，取下里头成熟的莲子。6.