分离和培养MEF细胞

分离和培养MEF细胞主要实验步骤：（冰上操作）1）处死：首先，将怀孕13.5-14.5天的小鼠拿到一个饭盒中，采用脱颈椎的方法将小鼠处死，将小鼠浸泡在酒精中2-3min。2）取胎鼠：将已处死的孕鼠拿到超净台上的大培养皿的盖子中，用一对剪刀和镊子剪开小鼠的腹部，取出胎鼠，边取边用剪刀将脐带剪开。3）取胚胎：将取出的胎鼠转移至大培养皿中（装有预冷的1×PBS），用剪刀将外面包裹的两层膜剪开（外面一层膜稍厚，里面一层膜稍薄，两层膜中间是羊水），取出胚胎。（冰上操作）4）去四肢和骨骼：将胚胎转移至新的装有预冷PBS的培养皿中，用一对镊子轻轻的将头、四肢及躯干骨骼剔除，仅留肉（主要是躯干上的嫩肉），特别注意去尽血（血长得快，会对MEF造成很大影响）。（冰上操作）5）消化：将组织块移至新的装有预冷PBS的培养皿中，用小剪刀剪碎（小于1mm3的组织块，取5倍体积（可以多一点点）胶原酶IV（5mg/mlinsurm-freeDMEM，0.22um抽滤），反复吹散组织块，并用巴氏管将组织悬液转移至15mL离心管中，37℃水浴锅中消化30-60min。加入等体积的PBS终止。6）过滤：将200目筛网置于一个新的培养皿中，将细胞悬液滴至筛网上过滤（如果比较粘稠滤不下去，可以再加一些PBS反复吹吸），过滤完后可用1mL培养基再冲洗一次。7）离心：将滤液转移至一个新的15mL离心管中，1000rpm离心5min。8）多聚赖氨酸处理培养皿：1ug/ml多聚赖氨酸（用水配成2mg/ml贮存液，用时用PBS稀释成工作浓度）润洗培养瓶，吸走多余的多聚赖氨酸，再用PBS洗一遍培养瓶。9）接种：弃上清，向沉淀中加1mL培养基，用枪将其吹打成细胞悬液。血球计数板计数，并按照一定密度接种于处理过的培养瓶。T75培养瓶可接种1×106细胞。用含有10%FBS,1%P/S的DMEM培养。10）换液：4小时后换新鲜培养基。