人类疾病动物模型概述(2016级研究生-2016年9月)

人类疾病动物模型概述中南大学基础医学院病理生理学系肖献忠一、基本概念1、生物：指一切具有新陈代谢、可生存、生长、繁殖的生命体，包括动物、植物、微生物。2、动物：指多细胞真核生命体，是生物中的一大类群，已知有150多万种，包括人类。3、实验动物：是指经专门培育、供生物医学实验研究使用的动物，要求来源清楚、遗传背景明确、微生物受到控制。4、人类疾病动物模型：是指具有人类疾病模拟表现的实验动物二、人类疾病动物模型的作用和意义1、避免了在人身上进行实验所带来的风险临床上对外伤、中毒、肿痛病因等研究是有一定困难的，甚至是不可能的，如急性和慢性呼吸系统疾病研究中很难重复环境污染的作用。辐射对机体的损伤也不可能在人身上反复实验。而动物可以作为人类的替难者，在人为设计的实验条件下可反复观察和研究。因此，应用动物模型，除了能克服在人类研究中经常会遇到的理论和社会限制外，还容许采用某些不能应用于人类的方法学途径，甚至为了研究需要可以损伤动物组织、器官或处死动物。2、可随时复制临床上平时不易见到的疾病如放射病、毒气中毒、烈性传染病,可以根据研究目的要求随时采用实验性诱发的方法在动物身上复制出来。3、可克服在研究某些潜伏期长、病程长和发病率低的人类疾病时所遇到的困难一般遗传性、免疫性、代谢性和内分泌等疾病在临床上发病率很低，研究人员可以有意识地提高其在动物种群的中发生频率，从而推进研究。如肿瘤等疾病发生发展很缓慢，有的可能要几年、十几年、甚至几十年。有些致病因素需要隔代或者几代才能显示出来，一个科学家很难有幸进行三代以上的观察，而许多动物由于生命的周期很短，在实验室观察多代都是容易的。4、可严格控制实验条件，提高研究的效率和研究结果的可靠性临床上疾病是十分复杂的，各种因素均起作用。病人的年龄、性别、体质、遗传等各不相同，对疾病的发生发展均有影响。采用动物来复制疾病模型，可以选择相同品种、品系、性别、年龄、体重、活动性、健康状态、甚至遗传和微生物等方面严加控制的各种等级的标准实验动物，用单一的病因作用复制成各种疾病，并严格控制温度、湿度、光照、噪音、饲料等实验条件，这样有利于获得可靠的实验结果，提高研究效率。在各种疾病研究中，同一时期内很难在病人身上取得一定数量的生物样本和数据资料，但在动物模型上容易实现。而且通过限定各种实验条件（如投服一定剂量的药物或移植一定数量的肿瘤等），可获得条件一致的模型材料和数据。5、可以简化实验操作和样品收集动物模型作为人类疾病的“缩影”，便于研究者按实验目的需要随时采取各种样本，甚至及时处死动物收集样本，这在临床是难以办到的。实验动物向小型化的发展趋势更有利于实验者的日常管理和实验操作。6、有助于更全面深刻地认识疾病的本质临床研究受到诸多限制，不便于采用一些工具药来进行疾病的机制研究，很难进行基因的操作，因此较难开展深入的疾病机制研究。而在人类疾病的动物模型上，可进行不同动物的比较研究和整合分析，可使用各种工具药（如激动剂、抑制剂），并进行各种基因操作（如转基因、基因敲除、基因表达抑制等），有利于从整体、离体、分子细胞等多个水平揭示疾病的发生机制，可使研究工作上升到立体水平来揭示疾病的本质。因此，利用人类疾病动物模型来研究人类疾病，对理解疾病发生、发展至关重要，对基因功能与疾病关系的分析、疾病发病机制的探讨、药物新靶点的发现及临床前药效学评价等都具有十分重要的作用和意义。但从动物模型获得的结果不能简单类推至人，只能供研究人类疾病参考，其结果还必须在人类疾病中获得验证。三、人类疾病动物模型的分类（一）按制备方法分类1、自发性动物模型（spontaneousanimalmodels）指不加任何人工诱发，在自然条件下动物自然产生的疾病，或者由于基因突变引起异常表型，通过遗传育种保留下来的动物疾病模型。以肿瘤遗传性疾病居多。优点：在一定程度上减少了人为的因素，更接近自然的人类疾病。缺点：种类有限，疾病动物饲养条件要求高，发病率低，发病时间长。自发肿瘤模型因动物种系、品种不同，其肿瘤所发生的类型和发病机制有差异自发性动物模型应用价值很高，在遗传性疾病、心血管病、免疫缺陷病、肿瘤等的研究上得到了广泛应用。近几十年来科学界十分重视自发性动物模型的开发。如与人类心脏病相似的加拿大犬；与儿童碳水化合物、氨基酸代谢失调相似的猫；自发性高血压和脑中风大鼠；青光眼兔；自发性糖尿病地鼠；肥胖症小鼠；裸鼠等等。2、诱发性动物模型（inducedanimalmodels）又称为实验性动物模型，指通过使用物理、化学、生物等致病手段，人为制造的疾病模型。物理因素诱发：如手术切除、外力致骨折、放射线致免疫抑制；化学因素诱发：如高油脂饲料致兔动脉粥样硬化、化学毒物中毒；生物因素诱发：如微生物感染；复合因素诱发：如豚鼠慢支用致病菌加寒冷或加SO2优点：制作方法简便，实验条件比较简单，其他因素容易控制，短时间内可大量复制。缺点：诱发的疾病模型与自然产生的疾病在某些方面有所不同。而且有些人类疾病不能用人工方法诱发出来。3、基因修饰动物模型（geneticallymodifiedanimalmodels)又称遗传工程动物模型，是指通过转基因、基因敲除、基因敲入、基因敲低等生物工程技术人为改变了动物遗传性状的动物模型，是研究人类基因功能、人类疾病及新药研发的重要工具，反应生命科学的发展趋势，新技术不断产生，日益受到学术界的重视。在本讲座中将做重点介绍。(二)、按疾病种类分类2、各系统疾病动物模型指模拟人类各系统疾病的动物模型，如神经（大鼠囊状脑动脉瘤）、心血管（小型猪动脉粥样硬化）、呼吸（豚鼠慢支）、消化（轮状病毒性肠炎）、内分泌与代谢（糖尿病）、泌尿等系统的疾病模型。1、基本病理过程动物模型指模拟各种基本病理过程的动物模型。如发热、炎症、休克、DIC、水电解质代谢紊乱、酸碱失衡等。1、抗疾病型动物模型（negativeanimalmodels）是指特定的疾病不会在某种动物身上发生。因此可借以探讨为何该种动物对该疾病有天然的抵抗力。如哺乳类动物均感染血吸虫病，而洞庭湖流域的东方田鼠却不能复制血吸虫病，故可用于血吸虫感染和抗病的研究。（三）、其它分类2、生物医学动物模型（biomedicalanimalmodels)是指利用健康正常动物的生物学特征来提供人类疾病相似表现的疾病模型。如沙鼠缺乏完整的脑基底Willis动脉环、动脉环后交通支，左右大脑供血相对独立，可用来结扎一侧颈动脉制备脑梗塞、脑缺血模型；鹿的正常红细胞是镰刀形的，多年来一直用于镰刀形红细胞贫血研究。四、人类疾病动物模型的制备原则1、相似性2、可重复性3、可靠性4、适用性和可控性5、易行性和经济性1、相似性所复制的模型应尽可能与人类疾病相同、相似，能够找到与人类疾病相同的动物自发性疾病当然最好。例如SHR就是研究人类原发性高血压的理想模型，老母猪自发性冠状动脉粥样硬化是研究人类冠心病的理想模型，自发性狗类风湿性关节炎与人类幼年型类风湿性关节炎十分相似等等。与人类完全相同的动物自发性疾病模型毕竟不可多得，往往需要人工加以复制。为了尽量做到与人类疾病相似，首先要注意动物的选择。例如，小鸡最适宜做高脂血症的模型，因它的血浆甘油三酯、胆固醇以及游离脂肪酸水平与人十分相似，低密度和极低密度脂蛋白的脂质构成也与人相似。如果动物模型与临床情况不相似，在动物身上有效的治疗方案就不一定能用于临床。例如，动物内毒性休克（单纯给动物静脉输入细菌内毒素所致的休克）与临床感染性（脓毒性）休克就不完全一样，因此对动物内毒素性休克有效的疗法（如抗炎症因子抗体）不能通过临床试验。2、可重复性理想的动物模型应该是稳定、可重复的，甚至是可以标准化的。例如用一次定量放血法可百分之百造成失血性休克和一定的死亡率，这就符合可重复性的要求。如何增强动物模型复制时的可重复性？注意在以下方面尽量保持一致：动物品种、品系、年龄、性别、体重、健康情况、饲养管理；实验及环境条件、季节、昼夜节律、应激、室温、湿度、气压；实验方法步骤；药品生产厂家、批号、纯度、规格；给药剂型、途径、剂量、浓度；麻醉、镇静、镇痛方法；仪器型号、灵敏度、精确度；实验者操作熟练程度等。3、可靠性复制的动物模型应该力求可靠地反映人类疾病，即可特异地、可靠地反映某种疾病或某种机能、代谢、结构变化，应具备该种疾病的主要症状和体征，经化验或X光照片、心电图、病理切片等证实。例如铅中毒可用大鼠做模型，但有它本身容易患地方性肺炎及进行性肾病，后者容易与铅中毒所致的肾病相混淆，不易确定该肾病是铅中毒所致还是它本身的疾病所致。用蒙古沙土鼠就比较容易确定，因为一般只有铅中毒才会使它出现相应的肾病变。4、适用性和可控性供医学实验研究用的动物模型，在复制时，应尽量考虑到今后临床应用和便于控制其疾病的发展，以利于研究的开展。如雌激素能终止大鼠和小鼠的早期妊娠，但不能终止人的妊娠。因此，用某些雌激素类药物在大鼠或小鼠研究终止妊娠的作用对人是没有意义的。有的动物对某致病因子特别敏感，极易死亡，也不适用。如狗腹腔注射粪便滤液引起腹膜炎，很快死亡（80%在24小时内死亡），来不及做实验治疗观察，而且粪便剂量及细菌菌株不好控制，因此不能准确重复实验结果。5、易行性和经济性在复制动物模型时，所采用的方法应尽量做到容易执行和合乎经济原则。如灵长类动物虽与人最相近，复制的疾病模型与人类疾病相似性最好，但灵长类动物稀少昂贵，即使猕猴也不可多得，更不用说猩猩、长臂猿。很多小动物如大小鼠、地鼠、豚鼠等也可以复制出十分近似的人类疾病模型。它们容易作到遗传背景明确，体内微生物可加控制，模型稳定，年龄、性别、体重等可任意选择，而且价廉易得、便于饲养管理，因此可尽量采用。除非不得已或一些特殊疾病（如痢疾、脊髓灰白质炎等）研究需要外，尽量不用灵长类动物。除了在动物选择上要考虑易行性和经济性原则外，而且在模型复制的方法、试剂、指标的观察上也都要注意这一原则。五、基因修饰动物模型的制备方法及其研究进展1、转基因动物模型2、基因敲除动物模型（经典方法、条件性敲除）3、基因敲入动物模型4、基因敲低动物模型5、基因修饰技术新进展（ZNF,TALENs,CRISPR/Cas9)1982年华盛顿大学的PalmiterRD将大鼠的生长激素基因注射到小鼠受精卵内,培育出体型明显大于正常小鼠的超级鼠,转基因小鼠A生长速度要比普通小鼠B的生长速度平均快50%，引起轰动。1、转基因动物（transgenicanimal)模型1987年世界上第一只商业化转基因绵羊诞生(英国Roslin研究所)；1989年精子载体法应用于转基因动物；1997年转基因克隆羊Dolly产生(Roslin研究所)，携带人凝血因子Ⅸ；1999年上海遗传研究所宣布转基因试管牛“滔滔”诞生三十多年来，转基因动物技术飞速发展，转基因兔、转基因猪、转基因牛、转基因鸡、转基因鱼等陆续育成。转基因动物技术已广泛应用于生物学、医学、药学、畜牧学等研究领域。转基因鼠转基因动物的概念将外源基因导入胚胎细胞并整合到基因组，使动物获得一个基因并能稳定遗传给后代的一类动物。（传统的转基因动物：外源基因随机整合,拷贝数不定)转基因动物制备原理转基因的基本方法显微注射法逆转录病毒法ES（胚胎干细胞）法精子载体法脂质体载体法电脉冲法基因枪法体细胞核移植技术（转基因克隆技术）1、显微注射法显微注射仪拉针仪煅针仪体视镜受精卵的采集受精卵的消化、培养消化、洗涤后的受精卵原核清晰的受精卵注射前注射后（3）受精卵的显微注射注射中受精卵的移植2、逆转录病毒法Retrovirus是只有一条单链RNA的病毒类的总称。逆转录病毒在逆转录酶（RT）的作用下可以将本身的单链RNA作为模板进行复制和遗传信息的传递。逆转录病毒通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞。原理逆转录病毒具有高效感染和在宿主细胞DNA上高度整合的特性。逆转录病毒能作为目的基因的载体，通过感染早期胚胎细胞实现基因转移，产生嵌合体动物，再经过杂交、筛选即可获得转基因动物。人或动物的胚