第二章发酵液预处理.

第二章发酵液预处理微生物经过好气性发酵可厌氧发酵培养后，菌体会大量繁殖，并合成和积累了相当浓度的代谢产物，这时便终于发酵，进入分离加工过程。不管是胞内产物还是胞外代谢产物，在分离纯化目的产物时，首先都要通过发酵液的预处理。将固相、液相分离后，才能采用各种物理、化学、生物的方法进行产物的进一步分离纯化。发酵液预处理是指采用凝集、絮凝、加热、稀释法等技术来加速固相、液相分离。过滤和离心是其最基本的单元操作。发酵液预处理技术水平高低、质量好坏，对减轻后续分离纯化的负荷、回收率、产品质量和生产成本等均具有重大影响。其中从发酵液中进行菌体的回收是目前发酵液预处理的瓶颈问题之一。第一节发酵液预处理的方法发酵产物在发酵液中的浓度较低，并与大量可溶的和混悬的杂质混杂在一起。发酵液黏度大，过滤性能差，所以在过滤前必须进行预处理。一、发酵液的一般特征不同的发酵过程所用的微生物、原料、培养基种类和发酵工艺过程各不相同，发酵液的特性也就各不相同，需根据不同发酵液的特性来合理选择和优化发酵液预处理的方法及条件。1、发酵液组成大部分是水，含水量达90%—99%；2、发酵液中发酵产物浓度较低，有的甚至在1%以下；3、发酵液中的悬浮固形物主要是菌体和蛋白的胶状物，粘度大，不易过滤，增加了后续的难度。4、发酵液中含有培养基中的残留成分，对后续提取、精制等操作产生影响；5、发酵液中含有少量的代谢副产物，其结构、理化特性与目标物极为相似，会对后续操作有影响；6、发酵液中含有色素、毒性物质等有机杂质，不仅增加提取过程的困难，还会对产品的质量、安全卫生标准等产生负面影响。二、发酵液预处理的目的和要求发酵液属于复杂的多相体系，产物浓度低，杂质组成复杂。若不经预处理，会使后续的过滤、离心操作速度过慢或无法进行，使发酵很难实现规模化的工业生产。例：枯草杆菌的发酵液P10（一）发酵液预处理的目的1、改变发酵液中固体颗粒的物理性质（忙改变表面类型、增大尺寸、提高硬度），加快悬浮液中固体颗粒的沉淀速度。2、尽可能使发酵产物转入后续工序处理的相中（多为液相）。3、能够除去部分杂质，减少后续处理的负荷。（二）发酵液预处理的要求1、菌体分离发酵液中除发酵产物外，还含有大量的菌体，为方便提取和精制，首先要将菌体与发酵液分离。为保证离心和过滤顺利进行，要正确控制发酵终点。否则对目标物的回收均不利。2、固体悬浮物的去除通过过滤处理，将发酵液中相当数量的固体悬浮杂质去除，获得透光度合格的澄清处理液。3、蛋白质的去除发酵液中去除菌体和固体悬浮物后，一些可溶性蛋白质仍留在滤液中，需设法去除。除去蛋白质的滤液要保证在一定的pH范围内不发生混浊，否则影响溶媒提取和离子交换提取。4、重金属离子的去除重金属离子的存在，会影响提取和精制，同时会影响发酵产物的质量和回收率，故必须除去。5、色素、热原质、毒性物质的去除针对药用发酵产品尤为重要。尤其是针剂。6、改变发酵液性质，以利于提取和精制后续工序的操作顺利进行当发酵终了时，发酵产物可能在发酵液中，也可以在菌体内部或两相同时存在。常采用调节pH、酸性或碱性的方法使发酵产物转入后续处理的相中。例：P117、调整适当pH值和温度避免引起产物的破坏和损失。三、发酵液预处理的方法从发酵液中分离固形物的速度，取决于发酵液的物理性质。不同的发酵液，其流动特性不同。细菌和放线菌的粘度较大；发酵液菌体自溶，存在核酸、蛋白质和其它有机杂质，呈悬浮液，且混浊。会导致过滤速度慢。常采用絮凝和凝聚的方法，使发酵液中的固体粒子增大，沉降速度提高；或稀释、加热、调整其它理化因子来降低粘度，以利于过滤。对后续提取影响最大的是高价的无机离子（钙、镁、铁）和杂蛋白，前者会影响离子交换的选择性，后者会造成离子交换容量降低和萃取分层困难。根据杂质的种类和性质的不同，采用不同的方法除去这些杂质。（一）凝集和絮凝1、凝集凝集是指在投加的化学物质作用下，发酵液中的胶体脱稳并使粒子相互凝集成为1mm大小块状絮凝体的过程。凝集剂的作用：粒子表面电荷的简单中和；消除粒子表面稳定的双电荷层；通过氢键或其它复杂的形式与粒子结合。最终使胶体粒子的排斥电位降低而发生聚沉。2、絮凝絮凝是指某些高分子絮凝剂能在悬浮粒子之间产生桥梁作用，使胶粒形成粗大絮凝团的过程。絮凝的作用：增大发酵液中悬浮粒子的体积；提高固液分离速度和滤液质量。（1）絮凝剂无机絮凝剂：使胶体的排斥电位降低而发生沉淀。有机絮凝剂：絮凝剂的活性基团通过静电引力强烈的吸附在胶粒表面上，降低胶粒双电层的排斥电位，在胶粒间产生架桥作用，使其相互连接成块状结构而沉淀。有机高分子絮凝剂含有离子化基团，分子中电荷密度很高，可以中和胶体的电性，起凝聚作用。细胞壁表面常带负电，一般常用阳离子絮凝剂处理发酵液。可析出沉淀物，也可改善分离后滤液的澄清度，同时可凝固部分可溶性杂蛋白，将滤液总蛋白含量降低，而对目标产物的活性无影响。（2）影响絮凝效果的因素絮凝剂种类：絮凝剂分子量在，链越长，吸附架桥效果越好，但在水中溶解度减小会对絮凝不利，故应分子量适当的絮凝剂；絮凝剂浓度：低浓度时，增大浓度有利于絮凝，但浓度过大同样会产生反作用；图2-1pH值：影响絮凝剂活性基团的解离，应选择合适pH值，使絮凝剂解离度最大，作用最好。图2-2搅拌和时间：搅拌速度和时间要控制在一个合理范围。图2-3凝集和絮凝是发酵液预处理的主要方法，是将化学药剂事先加入发酵液中，通过改变菌体细胞和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，然后再进行下一步分离。凝集和絮凝能使悬浮颗粒尺寸增加，并会加大颗粒的沉降速度，从而使过滤饼在深层过滤时产生较好的颗粒保留作用。3、对发酵液凝聚和絮凝方法的研究P13-14对不同的发酵液，首先应根据发酵液的性质、杂质的种类等，采用实验的方法进行絮凝剂和凝集剂的筛选；然后对筛选得到的絮凝剂或凝聚剂，再用实验的方法分别从絮凝剂或凝聚剂的用量、温度pH值、搅拌速度、时间等因素，进行絮凝或凝集处理条件的优化，达到提高絮凝效果的目的。（二）加热法前题：热稳定性高的发酵液。方式：最简单和廉价的预处理方法。将发酵液加热至所需温度并保持一定时间。效果：降低发酵液黏度，加速聚集作用以除去热变性杂蛋白，破坏凝胶状胶体结构，增加滤饼孔隙率，减少发酵液体积，达到固液分离的目的。（三）调节pH法作用：促进絮凝和凝聚作用；使存在于胞内的发酵产物转入液相中；使发酵产物以合适的离子状态或游离状态存在于发酵液中，防止其沉淀。例：去除四环素中钙、镁离子四环素能与钙、镁形成不溶解的化合物，沉积在菌丝体内，用草酸酸化后，能将其转入水相。（四）加水稀释法此法适用于离心沉降分离。对于悬浮固体发酵液，加水稀释至适当倍数，对后续离心沉降分离速度非常有利。例P14（五）加入助滤剂法作用：避免滤布或生成的滤饼阻塞而影响过滤。从发酵液中分离菌体、蛋白质等杂质时，悬浮物细小易受压，易阻塞或粘住过滤介质的细孔。加入助滤剂后，能在过滤介质和要分离的固形物之间形成一层不可压缩的多孔且极为细密的滤层，从而截留悬浮杂质。加入助滤剂后，使形成的滤饼疏松，具有较大孔隙，形成畅通的细密管道。助滤剂的使用方法：过滤器的滤布上预先涂上一层助滤剂，作为过滤介质使用，过滤后与滤布一起除去；将助滤剂按一定比例混入发酵液中，一起进入过滤器或离心机，使滤层形成疏松的滤饼，降低可压缩性，使过滤顺畅；将含助滤剂的发酵液通过压缩机，形成过滤介质层，然后再进行过滤，可提高滤饼渗透性。（六）加吸附剂或加盐法概念：将吸附剂加入到细菌发酵液的悬浮液中，使细菌细胞吸附在吸附剂上的方法。原理：在发酵液中形成庞大的絮状物把悬浮液中的悬浮粒子裹住，吸附在其中例：枯草杆菌发酵液中加入磷酸二氢钙或氯化钙，可与发酵液形成庞大凝胶。钙又与菌体自溶放出的核酸类物质生成不溶性盐，会沉淀，从而有助于过滤。（七）高价态无机离子去除的方法1、钙离子的去除钙的来源：发酵培养基中营养盐。去除方法：酸化剂去除。例：草酸除钙离子生成草酸钙沉淀，同时沉淀还能促使发酵液中的杂蛋白质凝固，提高过滤速度和滤液质量；同时能使四环素类从菌丝中转入水相。2、镁离子的去除加入磷酸盐，生成磷酸镁沉淀。同时还可去除钙离子与铁离子。通常加入的磷酸盐为三聚磷酸钠。3、三价铁离子的去除加入黄血盐，生成普鲁氏蓝沉淀而去除铁离子；加入碱化剂生成氢氧化铁沉淀。同时还能沉淀部分蛋白质。(八)可溶性杂蛋白的去除法1、等电点沉淀根据蛋白质的两性性质，在等电点时溶解度最低，易产生沉淀，用酸或碱调节发酵液pH值，使其达到蛋白等电点而沉淀。但有些蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度，还要结合其它的化学方法。2、热处理法加热使蛋白质变性，其空间结构发生改变，疏水基团暴露，溶解度降低易产生沉淀。在目标产物耐热允许的范围内，采用加热并保持一定时间，可去除可溶性杂蛋白。例：去除链霉素中杂蛋白pH值3.0，温度70℃,时间0.5h，使黏度降为原来的1/6，过滤速度提高10～100倍。3、吸附法利用吸附作用分离除去杂蛋白质。一般情况下，通过各种物理化学作用产生的沉淀均可吸附一定量的杂蛋白。例：在枯草杆菌的碱性蛋白发酵液中加入氯化钙和磷酸盐，会生成磷酸钙沉淀，此沉淀能吸附杂蛋白，同时还能起助滤剂作用。（九）色素及其他杂质的去除色素的产生：微生物生长代谢过程中分泌的；培养基中的营养物质直接带来的。去除方法：离子交换法、活性碳吸附法用DEAE-纤维素从含酶溶剂中吸附色素物质，同时还可除去非活性蛋白。提高纯化倍数。用强碱性阴离子交换剂对解朊酶的果胶酶溶液脱色，其活性损失较少。第二节发酵液的过滤经过发酵预处理后，即采用不同的方法和设备进行固液分离，得到澄清的发酵液，为下一步提取做准备。过滤和离心是目前应用的主要方法。体积较小的细菌和酵母菌，采用离心分离；细胞体积较大的丝状体（霉菌放线菌），采用过滤分离。一、发酵液过滤的目的1、为了获得含所需产物的细胞或发酵液；2、为了去除发酵液中的固形杂质。二、影响发酵液过滤的因素（一）菌种菌种决定了发酵液中各种悬浮粒子的大小和形状。真菌、霉菌和蛋白质絮凝团较粗大，易过滤分离，不做特殊处理，直接过滤。放线菌、细菌等体积小，菌丝体交织成网状，过滤困难，需先处理，凝固蛋白胶体后再选择适当的方法除去。（二）发酵液黏度影响发酵液黏度的因素：1、发酵条件2、放罐时间（发酵终了时间）3、发酵染菌4、发酵液的pH值、温度影响发酵液黏度的因素：1、发酵条件包括培养基组成、未用完的培养基、消沫剂、发酵周期等。2、放罐时间在菌体自溶前放罐。防止色素及胶状杂质增多，过滤困难。3、发酵染菌发酵液染菌后黏度增大，不利于过滤。4、发酵液的pH值、温度影响发酵液的黏度，影响过滤。三、发酵液过滤的方法（一）过滤在某一支撑物上放过滤介质，注入含固体颗粒的溶液，使液体通过，固体颗粒留下。1、常规过滤料液流动方向与过滤介质垂直。通常适于过滤直径较大的悬浮粒子。如放线菌、霉菌发酵液。对细小菌体或黏度较大的发酵液，需使用助滤剂。滤饼传统的过滤2、错流过滤料液流动方向与过滤介质平等的过滤方式。过滤介质为微孔滤膜或超滤膜，适用于悬浮粒子较小的发酵液。滤膜易污染，需常清洗。优点：在泵的推动下料液平行于膜面流动，料液流经膜面时产生的剪切力把膜面上滞留的颗粒带走，从而使污染层保持在一个较薄的水平。（二）离心分离适用于大规模分离过程。过滤式离心主要用于分离晶体和母液；沉降式离心适于分离含固形物较低的发酵液。设备：离心机缺点：经过滤或离心分离后，虽达到固液分离，但会使一些具有活性的发酵产物因机械破坏而造成损失。（三）发酵液不经固液分离提取避免活性物质损失，常采用此法。主要方法为离子交换法和萃取法。优点：有利于提高目标产物的回收率。四、提高过滤性能的方法降低滤饼比阻力：电解质、絮凝剂、凝固剂、助滤剂降低发酵液黏度：提高温度等降低悬浮液中悬浮固体浓度：尽可能降低培养基配料浓度。