1.4-肿瘤微环境响应型纳米药物载体

肿瘤微环境响应型纳米药物载体1肿瘤微环境概述如图7所示实体肿瘤中包含多种间质细胞包括肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associatedfibroblasts,CAFs）、肿瘤内皮细胞、肿瘤细胞、免疫细胞（T细胞，巨噬细胞，树突细胞和B细胞）、髓源抑制性细胞、细胞基质细胞和一些其他细胞等相互作用形成等。具有血液供应不充足、营养成分缺乏、细胞间质高压等特点。各种细胞类型都有其特殊的功能。这些细胞生长于包括胶原蛋白和蛋白聚糖在内的细胞外间质中。这些间质成分为肿瘤细胞的生长提供了很好的水合基质环境。CAFs是肿瘤基质的主要成分，发挥着分泌基质蛋白、生长因子、细胞因子和激素的作用。与正常组织中的成纤维细胞相比，CAFs细胞是更大的纺锤形间质细胞，能够促进肿瘤的发生、进展和转移。CAFs细胞与肿瘤细胞相互促进异型性进展。肿瘤细胞能够分泌一些生长因子影响CAFs，包括转化生长因子（transforminggrowthfactor-β1,TGF-β）和血小板来源生长因子（plateletderivedgrowthfactor,PDGF）。另一方面，CAFs能够分泌纤维细胞生长因子（fibroblastgrowthfactor,FGF），基质细胞衍生因子1（stromalcell-derivedfactor1,SDF1），基质蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs）和胰岛素样生长因子（IGF1），从而进一步的促进肿瘤生长、血管生成和肿瘤转移。除此之外免疫细胞是另一群人类肿瘤中非常重要的细胞群，能够分泌炎性因子调控肿瘤微环境。肿瘤浸润的淋巴细胞包括T细胞、B细胞和NK细胞发挥免疫应答的作用。图7肿瘤细胞以及肿瘤微环境中的主要细胞和细胞间质成分示意图。Paget提出“种子与土壤”的假说：将肿瘤细胞比喻为“种子”，肿瘤微环境比喻为“土壤”，种子的生长必须从周围的土壤获取营养成分，形象地揭示了肿瘤细胞生长对肿瘤微环境的依耐性。深入了解肿瘤微环境特点和肿瘤微环境与肿瘤细胞的相互作用关系，可以为抗肿瘤药物的研发提供一定的理论基础。在癌症的治疗过程中，以肿瘤微环境为靶点来设计抗癌新疗法是迫切需要的。研究者基于肿瘤微环境与正常组织之间的显著差异包括血管密度低、乏氧、弱酸性、还原性、酶过表达等特点来制定不同的研究策略。其中肿瘤局部血管的形成与肿瘤微环境也息息相关，血管可提供肿瘤有氧呼吸所需的氧气，对肿瘤的恶性增值具有重要作用。肿瘤组织新陈代谢所必需的氧气和营养都有肿瘤血管提供，促进肿瘤细胞迅速的生长并同时向远端转移。随着研究者们对肿癌治疗的深入研究，发现单纯靠杀死肿瘤细胞是不能够完全治愈癌症的，特别是在治疗过程中反复多次的给药引起的肿瘤耐药性，而肿瘤的转移和复发是导致愈后效果差和最终引起患者死亡的重要因素，研究发现肿瘤的多药耐药和转移与肿瘤微环境中基质细胞的损伤有关。肿瘤微环境和肿瘤细胞内信号可以激活纳米载药体系，将输送的基因和药物释放到肿瘤部位。癌症相关的刺激响应纳米系统已经越来越多地考虑用于递送抗癌药物，其主要靶向肿瘤微环境和/或细胞内信号以增强肿瘤内积聚并促进靶位点的药物释放。促进药物输送和释放的信号主要包括肿瘤和内吞酸性（pH），缺氧（Hypoxia），酶（Enzyme）过表达和高水平的细胞内谷胱甘肽（GSH），活性氧（ROS）和三磷酸腺苷（ATP）。因此，研发响应肿瘤微环境和肿瘤细胞内信号的纳米药物递送系统（DDS）是迫切需要的。如下示意图形象说明了肿瘤微环境和细胞内信号在肿瘤靶向和静脉给药后控制药物释放的作用过程。图1肿瘤微环境和细胞内信号在肿瘤靶向和静脉给药后药物释放的作用示意图。纳米载体在响应肿瘤细胞外信号，包括低pH，过度表达的癌症相关酶和缺氧之后可以被激活，增强肿瘤中的积聚和细胞摄取。抗癌药物可响应细胞内信号而选择性释放，包括低pH值，氧化还原电位，酶，ROS，缺氧和ATP2肿瘤微环境响应型纳米载药系统研究发现肿瘤微环境是一个缺氧、弱酸性并有多种不同免疫细胞组成的复杂微环境，对肿瘤的发生、恶性增殖及转移有极其重要的调控作用。因此，设计针对不同细胞和靶点的新型药物载体来抑制肿瘤已经是一种新的策略。常用的肿瘤微环境刺激因子有活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）、还原性物质、pH、酶、乏氧、三磷酸腺苷（ATP）等。肿瘤细胞内微环境也有着特异性，例如线粒体内高水平的氧化性H2O2，细胞质和内涵体/溶内存酶体内高浓度的谷胱甘肽（GSH），溶酶体和内涵体内的pH偏酸性（pH4.5-6.5）等。利用肿瘤微环境的特点来达到靶向治疗的广谱、低毒、耐药性小的目的，有效地切断肿瘤微环境与肿瘤细胞之间的相互作用，有效地抑制肿瘤细胞的生长。因此，可针对肿瘤微环境特殊的生理特性设计能够有效的响应这些刺激，靶向输送和释放基因/药物的纳米载药体系。在生物材料研究领域，许多科研工作者致力于研究生物响应性的纳米材料。这些材料的最大优势是能够有效地识别肿瘤局部生理条件的异常。肿瘤细胞微环境响应的纳米载药体系携带基因和药物之后需要满足在生理条件下稳定但是在肿瘤微环境靶向传递并且迅速释放，以提高肿瘤部位的药物富集量，减少药物在血液循环过程中损失，提高生物利用度，减少毒副作用，实现药物的有效释放。根据刺激因素的不同，可将刺激响应性纳米载体分为ROS响应，氧化还原响应，pH响应（酸），体内生物酶响应，乏氧响应、ATP响应，热响应以及其他响应。刺激响应型药物传递系统作为一种智能型载体系统，可对不同类型的刺激作出反应，从而将荷载的药物在特定的时间和空间进行控制性释放（如图1-2所示）。刺激响应型药物传递系统为实现高效的、精准的、多通路的肿瘤联合治疗创造了条件。根据引发响应的刺激信号来源不同，可分为内源刺激（Intrinsicstimuli）响应型药物传递系统和外源刺激（Extrinsicstimuli）响应型药物传递系统。内源性刺激信号来源于肿瘤病理环境的变化，主要有低pH值、高还原电势、酶浓度、体温过热等；外源性刺激信号主要有特定波长的激光、磁场、电场和超声波等。图1-2刺激响应型药物传递系统药物控释2.1内源刺激响应型药物传递系统内源刺激响应型药物传递系统在正常组织和血液中能保持载体与药物结构稳定，减轻药物对正常组织的损害。肿瘤微环境和正常组织之间pH值、谷胱甘肽（Glutathione,GSH）浓度、基质酶、温度等均存在差异，这些差异使得刺激响应型药物传递载体容易在肿瘤组织富集并特异性释放荷载药物，增强癌症治疗效果。2.1.1pH响应型纳米药物载体由于在癌症组织中的pH与正常组织相比具有较大的差异，因此pH响应性纳米载体得到了广泛的研究。肿瘤细胞与正常细胞之间pH值存在差异的主要原因是肿瘤细胞无限增殖，而肿瘤微弱的脉管系统不能提供足够的氧气和营养物质来满足肿瘤细胞的有氧呼吸，因此肿瘤组织经常在缺氧或无氧条件下进行无氧呼吸，无氧呼吸过程中会产生大量的乳酸，致使肿瘤组织转变为弱酸性。正常组织的接近中性pH（7.4），而大多数肿瘤细胞内的pH（≤6.5），利用肿瘤细胞内微弱的酸性来控制药物和基因输送与释放是响应性纳米载体的研究范围之一。含有乙缩醛、腙、肟、酰肼、氨基甲酸酯及酯类等化学结构的位置对pH敏感，可设计含有这些结构的载体材料。目前设计肿瘤微环境酸响应型的载体主要有以下两种方法：一种是利用一些不稳定化学键来制备载体，其在生理条件下稳定，但是在肿瘤的微酸环境下，化学键可发生断裂，使药物得到释放，提高药物摄取率。另一种是利用含有质子的基团的物质来合成载体。在不同酸性条件下这些化学功能键发生水解，使纳米载体在pH相对较低的肿瘤微环境下发生断裂，从而有效靶向释放被载物，达到输送药物与靶向治疗效果。表1-1用于联合治疗的pH响应型药物传递系统纳米载体载体材料传递药物两亲性线性-树枝状高分子甲氧基聚乙二醇-b-聚酰胺-胺嵌段聚合物DOX羟基喜树碱（HCPT）空心介孔二氧化硅（HMSNP）叶酸-聚乙烯亚胺包裹的HMSNPsDOXsiRNA阳离子胶束纳米颗粒双重pH响应的PDMA-b-PDPA嵌段聚合物Bcl-2siRNA，紫杉醇（PTX）聚合物胶束SMA-乙二酰肼通过腙键与DOX连接DOX双硫仑（DSF）前药纳米粒子羧基修饰的聚乳酸顺铂前药修饰的-D-TPGS顺铂多烯紫杉醇聚离子复合物胶束PEI-PEG共聚物，磺胺甲基嘧啶(SA)-PEG-NGRDOXDNAPEI：聚乙烯亚胺；PEG：聚乙二醇；PDMA-b-PDPA：聚（2-（二甲胺基）甲基丙烯酸乙酯)-b-聚二异丙基乙醇胺；SMA：聚苯乙烯-顺丁二酸苷；TPGS：d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯。利用肿瘤组织的微弱酸性这个特点，可将药物稳定运送到特定部位，可以将在血液循环过程中处于“沉默”状态的药物富集到肿瘤部位，在肿瘤微酸环境弱酸性条件下化学键断裂或使电荷解离，暴露出“激活”状态的药物，增强肿瘤细胞对药物的摄取，从而提高抗肿瘤效果并且降低毒性。Wang课题组设计了一种具有肿瘤微环境pH敏感性的去PEG化能力的三元复合物递送siRNA。阳离子复合物ssPEI800/siRNA通过静电吸附表面包被了一层具有肿瘤pH敏感性聚乙二醇化阴离子聚合物（PPC-DA）。在肿瘤细胞外温和的酸性条件下，中性条件下稳定存在的酰胺键快速水解暴露聚乙醇化的阳离子氨基PCC，因此PCC在静电排斥的作用下与带有高正电荷的阳离子复合物ssPEI800/siRNA解离，这就促进了siRNA的内吞并且增强了抗肿瘤活性，（如图2.3a）。电荷翻转也是肿瘤靶向输送的有效方法，在响应环境中酸度的变化后其表面电荷从增强循环的阴性逆转为阳性以增加细胞摄取或细胞内药物输送。对于对细胞外或细胞内肿瘤响应的药物递送系统，在中性条件下表面是负电荷，在肿瘤或者溶酶体酸性条件下转变为正电荷。Mo等人研发了一种线粒体靶向的脂质体(HHG2C18-L)能够循序地响应肿瘤微环境和细胞内不同部分的pH，表面的脂质层是一种合成的多功能的脂质体，包含1,5-双十八烷基-L-谷氨酰2-组氨酰六氢苯甲酸（HHG2C18）。生理pH条件下HHG2C18-L表面的负电荷能够在肿瘤pH条件下转换成正电荷，促进细胞内吞。在胞吞入内涵体后，组氨酸组对内涵体逃逸发挥质子缓冲作用，而羧酸基团因降解而脱落六氢苯甲酰胺。逃逸进入细胞质后，随着羧酸基团的去除，脂质体具有更高的正电荷，优先积累在脂质体上静电吸附驱动的线粒体。HHG2C18-L表现出相当高的抗癌性功效，加入合成的聚乙二醇化脂质确保脂质体在血液中的持久性增加对肿瘤生长的抑制作用，（如图2.3b）。图2.3pH响应型的肿瘤靶向。（a）具有肿瘤pH敏感性的去PEG化能力的三元复合物递送siRNA。（b）对肿瘤细胞外和细胞内酸度有响应的两性离子寡肽脂质体靶向线粒体输送药物。2.1.2酶响应型纳米药物载体酶在大多数代谢过程中作为大分子生物催化剂发挥重要作用。包括癌症在内的许多疾病的病理学与酶的功能障碍或其表达的失调有关。已有多种酶响应性纳米载药体系用于抗癌药物输送，其通过掺入可被肿瘤细胞外或细胞内环境过表达的酶识别和降解的特异性部分。与癌相关的酶包括基质金属蛋白酶（MMP），透明质酸酶（HAase）和组织蛋白酶（BcathepsinB）。表1-3用于联合治疗的酶响应型药物传递系统纳米载体载体材料传递药物杂化纳米粒子PEI-PEG通过可被MMP-2酶降解的多肽片段连接到氧化石墨烯上DOXDNA聚合物胶束树突装硫醇盐超支化聚甘油DOX前药甲氨蝶呤前药树枝状大分子MMP-2酶敏感的PEG-pp-PEI-PE共聚物PTXsiRNA肿瘤组织中的酶浓度和活性均显著高于正常组织，这些酶对肿瘤的生长、增殖及转移都有重要影响。酶具有高度的选择性，用特异性酶作为肿瘤治疗的靶点，是纳米载体研究的一个新的方向。金属蛋白酶（MMP）是一类在细胞基质中分解细胞组分的蛋白酶，其在肿瘤细胞中过度表达，对癌细胞的转移有重要影响。特别是MMP-2和MMP-9，在大部分肿瘤组织如胃癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌中都过度表