转基因花生外源基因田间漂移风险初步研究

２００９年９月２００９，３１（３）：３８３－３８５中国油料作物学报Ｃｈｉｎｅｓｅｊｏｕｒｎａｌｏｆｏｉｌｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅｓ转基因花生外源基因田间漂移风险初步研究陈坤荣，许泽永，晏立英，方小平（中国农业科学院油料作物研究所，湖北武汉４３００６２）　　摘要：用含花生条纹病毒壳蛋白（ｃｐ）基因和潮霉素筛选基因（ｈｙｇｒ）的转基因花生品系为材料，田间试验表明转基因花生中的ｈｙｇｒ基因可在短距离范围内随花粉漂移，离转基因花生种植区边缘１．０ｍ和３．０ｍ范围内漂移频率分别为４．４％和５．０％；３．０ｍ以外范围内，没有检测到ｈｙｇｒ基因随花粉发生漂移。各距离范围内均没有检测到ｃｐ基因随花粉漂移现象。因此认为，转基因花生外源基因漂移距离在３．０ｍ以内。关键词：转基因花生；ｃｐ基因；ｈｙｇｒ基因；基因漂移中图分类号：Ｓ５６５．２，Ｓ１８８　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００７－９０８４（２００９）０３－０３８３－０３ＰｒｉｍａｒｙｒｉｓｋａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｅｓｃａｐｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｅａｎｕｔｉｎｆｉｅｌｄＣＨＥＮＫｕｎ－ｒｏｎｇ，ＸＵＺｅ－ｙｏｎｇ，ＹＡＮＬｉ－ｙｉｎｇ，ＦＡＮＧＸｉａｏ－ｐｉｎｇ（ＯｉｌＣｒｏｐｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡＡＳ，Ｗｕｈａｎ４３００６２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｅａｎｕｔｌｉｎｅｓｈａｒｂｏｒｉｎｇｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ（ｃｐ）ｇｅｎｅｏｆｐｅａｎｕｔｓｔｒｉｐｅｖｉｒｕｓ（ＰＳｔＶ）ａｎｄｈｙｇｒｇｅｎｅｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒｒｉｓｋａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｅｓｃａｐｅｉｎｆｉｅｌｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｈｙｇｒｇｅｎｅｅｓｃａｐｅｗａｓ４．４％ａｎｄ５．０％ｗｉｔｈｉｎ１．０ｍｅｔｅｒａｎｄ３．０ｍｅｔｅｒｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｆｒｏｍｐｌａｎｔｉｎｇａｒｅａｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｅａｎｕｔｐｌａｎｔｓ．Ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｈｙｇｒｇｅｎｅｅｓｃａｐｅｂｅｙｏｎｄ３ｍｅｔｅｒｆｒｏｍｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｅａｎｕｔｐｌａｎｔｓ．Ｎｏｐｏｌｌｅｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄｃｐｇｅｎｅｅｓｃａｐｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｉｓｔａｎｃｅｓｆｒｏｍｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｅａｎｕｔｐｌａｎｔｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｅａｎｕｔ；ｃｐｇｅｎｅ；ｈｙｇｒｇｅｎｅ；Ｇｅｎｅｅｓｃａｐｅ收稿日期：２００９０１１１基金项目：国家自然科学基金项目（３０３７０２３８）作者简介：陈坤荣（１９６２－），男，江苏省吴江市人，副研究员，博士，从事植物病理和转基因安全研究　　２０世纪８０年代以来，随着基因工程技术的不断发展，转基因植物及其产业化研究取得了令人瞩目的成就。据国际农业生物技术应用推广协会（ＩＳＡＡＡ）统计，２００７年全球有２３个国家种植了１．１４３亿公顷转基因农作物［１］。预计２０１０年全球转基因作物的交易额将达到１００亿美元。人类对高产优质、抗病抗逆生物的需要，以及对低成本高产出的追求，无疑将促使转基因技术的深入研究和转基因植物的大规模产业化。在大量转基因植物产业化及转基因产品商品化的同时，人们对转基因植物及其产品的安全性越来越受重视［２］。转基因植物及产品安全性主要包括受体植物安全性风险、生态环境安全性风险和毒理安全性风险等［３］。其中，对转基因植物外源基因逃逸风险评估是生态环境安全性评估重要内容之一。根据花粉转播的最远距离，可以确定适当的隔离带，以降低转基因作物花粉对非转基因植物及近缘种的污染。近年来，国内外学者对此开展了广泛的研究。研究表明，棉花、高梁、粟、马铃薯、油菜、甜菜、向日葵、西瓜、芥菜和拟南芥等转基因作物花粉转播距离为１０～１０００ｍ［４］。在花生遗传转化研究方面，国内外均有许多成功的报道［５］，但目前还未见转基因花生生态安全性评估的报道。本文以转花生条纹病毒ｃｐ基因和ｈｙｇｒ基因的花生品系为材料，首次报道转基因花生外源基因的漂移距离和频率，为转基因花生环境安全性提供依据。１　材料和方法１．１　供试材料选用转基因花生品系作为基因漂移的供体，该品系是通过基因枪介导将花生条纹病毒ｃｐ基因和潮霉素筛选基因（ｈｙｇｒ）导入中花３号获得［６］。１．２　方法１．２．１　试验设计　试验于２００５年在油料所农场隔离区进行。转基因花生材料播于试验地中央，面积约５０ｍ２，其南北两边种植非转基因花生品种中花３号。田间管理同常规生产田，花生成熟后按离转基因花生边缘４个不同距离区（０．０～１．０ｍ、１．０１～３．０ｍ、３．０１～６．０ｍ和６．０１～１０ｍ）分别收获花生种子。１．２．２　花生总ＤＮＡ提取　将收获的不同距离区花生按单粒播于网室沙盘内，出苗后取嫩叶，采用改良ＣＴＡＢ法［７］提取单株花生总ＤＮＡ。１．２．３　ＰＣＲ检测外源基因　根据花生条纹病毒ｃｐ基因和ｈｙｇｒ基因序列各设计一对引物，扩增ｃｐ基因的上游引物：５′－ＴＧＧＡＧＡＴＧＡＧＣＡＡＧＴＡＧＡＡ－３′、下游引物：５′－ＧＴＴＣＴＴＣＣＧＧＣＴＴＡＣＴＣＡ－３′；扩增ｈｙｇｒ基因的上游引物：５′－ＡＡＡＡＧＴＴＣＧＣＡＧＣＧＴＣＴＣＣＧＡＣＣ－３′、下游引物：５′－ＴＴＧＧＣＡＧＣＣＴＣＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＴＣＣ－３′，由上海博亚生物技术公司合成。ＰＣＲ反应总体积为２０μＬ，包含５０ｎｇ花生ＤＮＡ，１．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，０．２５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ，０．５ｍｍｏｌ／Ｌ上下游引物，１ＵＴａｑＤＮＡ合成酶。ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ和ＴａｑＤＮＡ合成酶购自上海Ｐｒｏｍｅｇａ公司。ＰＣＲ反应程序为９４℃，３ｍｉｎ；接着９４℃，４５ｓ；４５℃，５０ｓ；７２℃，９０ｓ；３２个循环；最后，７２℃，７ｍｉｎ。反应产物用１％的琼脂糖胶电泳，以２００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒ为分子量标记，紫外检测仪上观察结果。２　结果与分析２．１　花生ＤＮＡ提取采用ＣＴＡＢ方法，分别提取了离转基因花生区边缘０．０～１．０ｍ、１．０１～３．０ｍ、３．０１～６．０ｍ和６．０１～１０ｍ４个区的１８０株、１８０株、３３０株和３１５株花生ＤＮＡ。每个花生ＤＮＡ样品，经紫外分光光度计测定浓度后，用灭菌水稀释至工作浓度（约５０ｎｇ／μＬ），置－２０℃冰箱中备用。２．２　外源基因随花粉漂移距离和频率离转基因花生４个不同距离区的共１００５个ＤＮＡ样品分别用２对引物进行ＰＣＲ扩增。在检测的１００５个ＤＮＡ样品中均没有发现花生条纹病毒ｃｐ基因特异性带。在离转基因花生０．０～１．０ｍ和１．０１～３．０ｍ区的各１８０个ＤＮＡ样品中，分别检测到９个和８个ｈｙｇｒ基因阳性样品，阳性样品率分别为５．０％、４．４％。离转基因花生３．０１～６．０ｍ和６．０１～１０ｍ区的３３０个和３１５个ＤＮＡ样品没有检测到ｈｙｇｒ基因（表１）。结果初步说明转基因花生的外源基因可在３．０ｍ范围内随花粉漂移。表１　转基因花生外源基因飘移距离和频率检测结果Ｔａｂｌｅ１　Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｅｓｃａｐｅｄｉｓｔａｎｃｅａｎｄｆｒｅｑｕｅｎｃｙｆｒｏｍｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｅａｎｕｔ离转基因花生距离／ＤｉｓｔａｎｃｅｆｒｏｍＴＰ检测花生株数Ｔｅｓｔｐｌａｎｔｓｃｐ基因样品数／％ｃｐｐｏｓｉｔｉｖｅｓａｍｐｌｅｓｈｙｇｒ基因样品数／％ｈｙｇｒｐｏｓｉｔｉｖｅｓａｍｐｌｅｓ０～１．０１８００（０．０）９（５．０）１．０１～３．０１８００（０．０）８（４．４）３．０１～６．０３３００（０．０）０（０．０）６．０１～１０．０３１５０（０．０）０（０．０）　　：ＴＰ＝ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｅａｎｕｔ３　讨论本文通过对转基因花生自然条件下外源基因漂移距离进行了研究，初步结果说明，在离转基因花生种植区边缘３．０ｍ范围内，外源基因（ｈｙｇｒ基因）漂移频率可达４．４％～５．０％，但在同批试验样品中没有检测到ｃｐ基因。离转基因花生种植区边缘３．０ｍ以外范围内，外源基因漂移率急剧下降，没有检测到基因漂移发生。本研究中所用的转基因花生是通过基因枪将构建在２个质粒上的ｃｐ目的基因和ｈｙｇｒ筛选基因同时导入花生的。外源基因在随花粉漂移中，ｈｙｇｒ基因在短距离范围内达到较高频率，而ｃｐ基因没有检测到。这是由于检测样品数不够，还是其他原因导致的需作进一步研究。转基因植物花粉传播距离与多种因素有关，包括转基因植物生物学花粉特性、转基因植物种植面积、气候和环境条件等［４］。自花授粉作物花粉传播距离明显低于异花授粉作物，同种转基因作物在不同的试验中，花粉传播距离也有很大差异。花生是自花授粉作物，试验表明，在自然种植条件下仅在短距离范围内基因随花粉漂移，不会发生远距离扩散，种植转基因花生对生态环境是安全的。这与陈小勇报道的对花生转基因逃逸风险初步评价结果是一致的［８］。参考文献：［１］　ＩＳＳＡＡ：全球２００７年转基因作物种植面积增长１２％４８３中国油料作物学报　２００９，３１（３）［Ｊ］．生物技术产业，２００８，（２）：４．［２］　刘　谦，朱鑫全．生物安全［Ｍ］．北京：科学出版社，２００１．２３８－２４０．［３］　郭建英，万方浩，韩召军．转基因植物生态安全性风险［Ｊ］．中国生态农业学报，２００８，１６（２）：５１５－５２２．［４］　陈兴玲，胡建军，赵楠木．转基因植物基因漂移研究［Ｊ］．安徽农业科学，２００７，３５（１０）：２８５１－２８５２．［５］　许泽永，廖伯寿，晏立英，等．转基因花生研究进展［Ｊ］．中国油料作物学报，２００７，２９（４）：４８９－４９６．［６］　陈坤荣，许泽永，晏立英，等．基因枪介导的花生条纹病毒壳蛋白基因转化花生研究［Ａ］．第三届湖北湖南植保农药学术研讨会论文集［Ｃ］．武汉：中国农业出版社，２００４：１３３－１３８．［７］　奥斯伯Ｆ，金斯顿ＲＥ，赛德曼ＪＣ，等．精编分子生物学实验指南［Ｍ］．北京：科学出版社，１９９８．［８］　陈小勇．我国主要农作物转基因逃逸生态风险的初步评价［Ｊ］．农村生态环境，１９９８，１４：櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔５－１０．（上接第３７９页）［３］　袁慧君，傅　红，饶平凡，等．反式脂肪酸红外光谱和气相色谱分析［Ｊ］．粮食与油脂，２００７，（２）：４０４１．［４］　宋立华，李云飞，汤　楠．食品中反式脂肪酸的分析方法研究进展［Ｊ］．上海交通大学学报，２００７，２５（１）：８０８５．［５］　ＤａｇｌｉｏｇｌｕＯ，ＴａｓａｎＭ，ＴｕｎｃｅｌＢ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｔｏｔａｌｔｒａｎｓｆａｔｔｙａｃｉｄｓｏｆＴｕｒｋｉｓｈｂｉｓｃｕｉｔｓｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｇａｓｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ［Ｊ］．ＥｕｒｏｐｅａｎＦｏｏｄＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００，２１１：４１４４．［６］　ＯｌｉｖｅｉｒａＭＡ，ＳｏｌｉｓＶＥ，ＧｉｏｌｅｌｌｉＬＡ，ｅｔａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｆｏｒｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｒａｎｓｆａｔｔｙａｃｉｄｓｉｎｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄｏｉｌｓｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００３，２４：１６４１１６４７．［７］　宋志华，单　良，王兴国．毛细管气相色谱法测定精炼和氢化大豆油中的反式脂肪酸［Ｊ］．中国油脂，２００６，３１（１２）：３７４０．［８］　佘珠花．气相色谱法中油脂脂肪酸衍生化方法及其选择［Ｊ］．粮油加工，２００４，（６）：６４．［９］　佘珠花，李永明．气相色谱油脂衍生化条件与油脂酸度关系探讨［Ｊ］．武汉工业学院学报，２００５，２４（１）：１６１７．５８３陈坤荣等：转基因花生外源基因田间漂移风险初步研究