药用植物生物技术复习资料(2012-9-22)

1第一章药用植物组织培养基的概念一、药用植物组织培养（MedicinalPlanttissueculture）药用植物的无菌培养技术（或药用植物的克隆技术），是根据植物细胞具有全能性（totipotency)的理论，利用药用植物的离体器官、组织（或细胞）等，在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后分化、生长成完整植株的过程。二、药用植物组织培养的特点1、整个过程都是在无菌条件下进行；2、主要在人工培养基上进行；3、起始材料植物的器官、组织、细胞、原生质体；4、组织培养物经过连续继代培养可经不断增殖，形成克隆（clone，也称无性繁殖系)；5、组织培养容器是在封闭的容器中进行；6、组织培养条件的环境温度（25℃)、光照强度(1500lx)和时间(16h/d)等是人为控制的。三、药用植物组织培养的研究类型1、根据外植体来源和培养对向不同分类。（1）组织培养；（2）器官培养；（3）胚胎培养；（4）细胞培养；（5）原生质体培养。2、根据培养基不同分类。（1）固体培养：培养基中加入凝固剂。（2）液体培养：振荡培养、旋转培养、静止培养。四、药用植物组织培养的优越性1、繁植物速度快，繁殖系数高；2、不受季节限制，可周年大规模工厂化生产；3、经济效益高；4、所用繁殖材料少；5、种苗去除病毒、真菌、细菌等病害；6、能够获得完全具有高度一致而同时具有优良表型的组培苗；7、生长快，周期短，重复性好；8、药作植物生理活性物质的生产和次生代谢产物的生产。五、植物组织培养的形成与发展1、植物组织培养的开创（19世纪中期）；2、植物组织培养的奠基（20世纪30～50年代）；3、植物细胞培养的建立。六、药用植物组织培养的应用1、药用植物的快速繁殖；2、去除病毒；3、药用植物育种；4、药用植物有效成分的形成和生产；5、种质资源的离体保存。2第二章药用植物组织培养的原理一、植物细胞全能性理论：每个植物细胞带有该植物的全部遗传信息，在适当条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分化出植物有机体所有不同类型的细胞，形成不同类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。二、脱分化和再分化1.脱分化（也称去分化）：指离体条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织的细胞团或愈伤组织或成为未分化细胞特性的细胞的过程。2.再分化：离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的变化和明显的机能分化，从而形成各种类型的细胞。三、愈伤组织培养指将外植体接种到无菌培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。愈伤组织形态发生：器官发生型；体细胞胚胎发生型。1.愈伤组织器官发生顺序：（1）先形成芽，在芽伸长后，再在芽的基部长出根而形成植株；（2）先形成根，再从根的基部上长出芽而形成植株；（3）愈伤组织不同部位分别形成芽和根，然后形成维管组织把两者结合起来形成植株；（4）仅有芽和根形成。2.影响细胞脱分化的因素①损伤；②生长调节剂；③光照；④细胞位置；⑤外植体的生理状态。3．体细胞胚胎发生：（1）植物体细胞胚胎发生在离体培养条件下，植物离体培养的细胞、组织、器官也可以产生类似胚的结构，其形成也经历一个类似胚胎的发生和发育过程，这种类似胚的结构称为胚状体。成熟的胚状体也可以像合子胚一样长出根、芽，萌发再生植株。（2）体细胞胚胎发生途径①直接途径：指从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎。②间接途径：指从外植体先脱分化形成愈伤组织，再从某些细胞分化出体细胞胚胎。四、影响植物离体形态发生的因素1、植物种类和基因型；2、培养材料的生理状态；3、培养基；4、培养条件。五、药用植物快速繁殖的途径1．器官型；2．器官发生；3．胚状休发生型；4．原球茎型；5．球茎芽型；6．块茎型；7．鳞茎型；8．根茎型；9．微小短枝扦插型；10．孢子型。3第三章药用植物组织培养实验室及基本操作一、药用植物组织培养的基本操作：1.各种玻璃器皿的洗涤、灭菌；2.培养基的配制、灭菌；3.无菌室的消毒及其接种操作。二、药用植物组织培养实验室（一）准备室主要进行一些常规的实验操作。1.植物组织培养中所需器具的清洗、干燥和保存；2.蒸馏水的生产；3.培养基的配制和灭菌；4.常规的生理生化分析。（二）无菌操作室进行植物材料的消毒、接种以及培养物的继代转接操作的场所。室内保持无尘、清洁状态。（三）培养室接种好的材料的培养，使其生长分化。1.温度控制：25±2℃；2.光照：光照强度1000～6000lx，光照时间10～16h/d；3.湿度：相对湿度保持在70％～80％为宜。（四）温室试管苗驯化、移栽的场所。二、药用植物组织培养器皿和器械：1.玻璃器皿；2.器械类。三、药用植物组织培养仪器设备1.无菌操作设备；2.培养设备；3.药品贮存和配制仪器设备；4.观察分析仪器设备：5.其他仪器设备。四药用植物组织培养基本操作（一）、洗涤；（二）灭菌：1.器具的灭菌：(1)干热灭菌法；(2)高压蒸汽灭菌法。2.培养基的灭菌：（1）高压蒸汽灭菌法；（2）过滤除菌法；（3）无菌操作。五、药用植物组织培养培养基1、培养基的构成：（1）水分；（2）无机盐类；（3）有机营养成分；（4）植物生长调节剂；（5）天然有机添加物质；（6）PH值；（7）凝固剂；（8）其他添加物。2.培养基的配制：（1）培养基母液的配制：①大量元素贮藏液；②钙盐贮藏液；③微量元素贮藏液；④铁盐贮藏液；⑤有机元素贮藏液。（2）植物生长调节剂母液的配制：配制成0.1mg/ml。（3）培养基配制以配制1000mL滇龙胆愈伤组织诱导培养基MS+KT0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、pH5.6为例。1.取出MS培养基贮藏液；取出KT、NAA贮藏液；取出蔗糖、琼脂；取出各种玻璃器皿；42.加蒸馏水：取一只1000mL烧杯加入500mL蒸馏；3.取MS贮藏液：用移液管依次将贮藏液加入到烧杯中，MS－A20mL，MS－B10mL，MS－C10mL，MS－D10mL，MS－E5mL；3.加植物生长调节剂：0.1mg/mL。KT5.0mL，NAA1.0mL；4.加蔗糖：30g；5.定容：补加蒸馏水到1000mL；6.调整pH值：5.6；7.加琼脂：8g；8.培养基加热熔解：温度控制在90℃以下；9.培养基分装：将培养基分装到培养容器中，250mL三角瓶中分装50mL；10.培养基高压灭菌：用高压灭菌锅，121℃保持15～20min；11.灭菌结束后待高压灭菌锅温度到50℃以下时，取出培养一角瓶，冷凝备用。5第四章药用植物离体无性繁殖方法一、药用植物离体无性繁殖的步骤1.材料的初代培养；2.材料的增殖及继代培养；3.试管苗生根和移栽。二、外植体的灭菌和消毒1.茎尖、茎段、叶片的灭菌：外植体→70～75%酒精10～30s→无菌水洗涤→2～10%NaClO消毒6～15min→无菌水洗涤3～5次→备用。2.根、块茎、鳞茎的灭菌：外植体→70～75%酒精10～30s→无菌水洗涤→0.1～0.2%消毒HgCl25～12min（Tween-80，或6～10%NaClO15～20min)→无菌水洗涤3～5次→备用。三、无菌操作1、无菌环境的建立（1）外植体：无菌；（2）培养基：高压蒸汽灭菌锅内121℃下保持15-20min；（3）接种器械：镊子类、解剖刀高压蒸汽灭菌锅内121℃下保持15-20min（或者用铝箔包好150℃恒温干燥箱保温2h）冷却后使用。2、无菌操作步骤无菌操作台用75%酒精喷雾→开紫外灯30min→手和小臂用70%酒精消毒→点燃无菌操作台上的酒精灯→镊子、解剖刀用90%酒精浸泡→镊子、解剖刀酒精灯火烧灭菌冷却备用→在植物材料移入或移出培养瓶前后需酒精灯上火烧灭菌。3、培养条件(1)温度：培养室温度25℃±2℃；(2)光：①光照强度：1000~3000lx；②光照长度：10～16h/d；③光质：不同波长的光照；（3）渗透压；（4）酸碱度；（5）通气四、外植体的生长分化1、丛生芽发育：指从顶芽或腋芽中萌发的单苗或多苗。（1）培养方式：茎培养；侧芽培养；带腋芽茎段（节）培养。（2）丛生芽发育方式：茎尖、侧芽等→直接再生丛生芽→幼茎→生根→再生植株2、不定芽发育：指经愈伤组织阶段诱导产生小植株。根、茎、叶等→愈伤组织→生长点→幼茎→生根→再生植株3、胚状体发育：体细胞经过诱导产生体细胞胚（胚状体）完成植株再生。植物体细胞→胚状体→再生植株64、原球茎发育：兰科植物从茎尖或侧芽培养中产生原球茎并增殖、萌发出植株。五、试管苗的生长环境特点1.无菌；2.有营养供给；3.适宜光照；4.适宜培养温度；5.100%的湿度环境。六、试管苗的生根和移栽1．壮苗培养壮苗培养：将丛生苗分割成单苗，使其茎干变粗，叶色浓绿。方法：培养基添加生长延缓剂（多效唑、B等9）；降低培养温度、增强光照；添加香蕉或马铃薯汁等。2、生根培养(1)了解植物种类和品种的差异；(2)延长增殖培养时间，保证根系达到一定长度；(3)降低培养基矿质元素，1/2MS或1/4MS；(4)降低细胞分裂素浓度，增加生长素浓度。3、炼苗及移栽药用植物组织培养的关键技术。炼苗及移栽方法试管苗从培养室→室外（或温室）→炼苗3～5d→打开瓶盖加少量自来水→继续炼苗3～5d→取出试管苗→洗净根部粘带的培养基→移栽基质（花盆或温室）。4、移栽后管理(1)移栽基质：蛭石、珍珠岩、沾沙、谷壳、锯木屑；(2)温度：白天23±3℃，夜间23±3℃；(3)水分：1～3d不浇水，2d浇一次，每天喷水一次；(4)光照：8～10h/d，光照强度10000～15000lx；(5)湿度：保持栽培环境湿度80%～90%；(6)肥料：移栽2～3d后喷施较低浓度的营养液。七、影响药用植物组织培养的因素1．药用植物种类和品种；2．外植体特性；3．药用植物种类和品种；4．培养条件；5．继代培养。