GB4789302010食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验

中华人民共和国国家标准GB4789.30—2010食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexamination:Listeriamonocytogenes中华人民共和国卫生部发布2010-03-26发布2010-06-01实施GB4789.30—2010I前言本标准代替GB/T4789.30-2008《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》。本标准与GB/T4789.30-2008相比，主要变化如下：——修改了标准的中英文名称；——删除“第二法全自动酶链荧光免疫分析仪筛选法”；——删除“第三法全自动病原菌检测系统筛选法”。本标准的附录A为规范性附录。本标准所代替标准的历年版本发布情况为：——GB4789.30-1994、GB/T4789.30-2003、GB/T4789.30-2008。GB4789.30—20101食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验1范围本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的检验方法。本标准适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。2设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1冰箱：2℃～5℃。2.2恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃。2.3均质器。2.4显微镜：10×～100×。2.5电子天平：感量0.1g。2.6锥形瓶：100mL、500mL。2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。2.8无菌平皿：直径90mm。2.9无菌试管：16mm×160mm.。2.10离心管：30mm×100mm。2.11无菌注射器：1mL。2.12金黄色葡萄球菌（ATCC25923）。2.13马红球菌（Rhodococcusequi）。2.14小白鼠：16g～18g。2.15全自动微生物生化鉴定系统。3培养基和试剂3.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）：见附录A中A.1。3.2含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。3.3李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见附录A中A.3。GB4789.30—201023.41%盐酸吖啶黄（acriflavineHCl）溶液：见附录A中A.3.2.1。3.51%萘啶酮酸钠盐（naladixicacid）溶液：见附录A中A.3.2.1。3.6PALCAM琼脂：见附录A中A.4。3.7革兰氏染液：见附录A中A.5。3.8SIM动力培养基：见附录A中A.6。3.9缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红（MR）和V-P试验用]：见附录A中A.7。3.105%～8%羊血琼脂：见附录A中A.8。3.11糖发酵管：见附录A中A.9。3.12过氧化氢酶试验：见附录A中A.10。3.13李斯特氏菌显色培养基。3.14生化鉴定试剂盒。GB4789.30—201034.检验程序单核细胞增生李斯特氏菌检验程序见图1。图1单核细胞增生李斯特氏菌检验程序5操作步骤5.1增菌以无菌操作取样品25g（mL）加入到含有225mLLB1增菌液的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min～2min；或放入盛有225mLLB1增菌液的均质杯中，8000r/min～10000r/min均质1min～2min。于30℃±1℃培养24h，移取0.1mL，转种于10mLLB2增菌液内，于30℃±1℃培养18h～24h。5.2分离取LB2二次增菌液划线接种于PALCAM琼脂平板和李斯特氏菌显色培养基上，于36℃±1℃培养24h～48h，观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；典型菌落在李斯特氏菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。5.3初筛自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管，于36℃±1℃培养24h；同时在TSA-YE平板上划线纯化，于30℃±1℃培养24h～48h。选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。30℃±1℃，18h～24h30℃±1℃，24h检样25g(mL)样品+LB1增菌液225mL，均质0.1mL+10mLLB2增菌液36℃±1℃，24h～48h李斯特氏菌显色培养基PALCAM琼脂接种木糖、鼠李糖，36℃±1℃，24h；同时于TSA-YE平板划线纯化，30℃±1℃，24h～48h木糖－，鼠李糖＋鉴定结果报告GB4789.30—201045.4鉴定5.4.1染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（0.4μm～0.5μm）×（0.5μm～2.0μm）；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。5.4.2动力试验：李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。5.4.3生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。5.4.4溶血试验：将羊血琼脂平板底面划分为20个～25个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌)，穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36℃±1℃培养24h～48h，于明亮处观察，单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。5.4.5协同溶血试验(cAMP)：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，于30℃±1℃培养24h～48h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强，斯氏李斯特氏菌的溶血也增强，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。5.5可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统等对5.3中3个～5个纯培养的可疑菌落进行鉴定。表1单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别菌种溶血反应葡萄糖麦芽糖MR-VP甘露醇鼠李糖木糖七叶苷单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)＋＋＋＋/＋－＋－＋格氏李斯特氏菌(L.grayi)－＋＋＋/＋＋－－＋斯氏李斯特氏菌(L.seeligeri)＋＋＋＋/＋－－＋＋威氏李斯特氏菌(L.welshimeri)－＋＋＋/＋－V＋＋伊氏李斯特氏菌(L.ivanovii)＋＋＋＋/＋－－＋＋英诺克李斯特氏菌(L.innocua)－＋＋＋/＋－V－＋注：＋阳性；－阴性；V反应不定。5.6小鼠毒力试验（可选择）将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中，于30℃±1℃培养24h，4000r/min离心5min，弃上清液，用无菌生理盐水制备成浓度为1010CFU/mL的菌悬液，取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3只～5只，每只0.5mL，观察小鼠死亡情况。致病株于2d～5d内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性。6结果与报告综合以上生化试验和溶血试验结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。GB4789.30—20105附录A（规范性附录）培养基和试剂A.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)A.1.1成分胰胨17.0g多价胨3.0g酵母膏6.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5g蒸馏水1000mLpH7.2～7.4A.1.2制法将上述各成分加热搅拌溶解，调节pH，分装，121℃高压灭菌15min，备用。A.2含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)A.2.1成分胰胨17.0g多价胨3.0g酵母膏6.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5g琼脂15.0g蒸馏水1000mLpH7.2～7.4A.2.2制法将上述各成分加热搅拌溶解，调节pH，分装，121℃高压灭菌15min，备用。A.3李氏增菌肉汤(LB1，LB2)A.3.1成分胰胨5.0g多价胨5.0g酵母膏5.0g氯化钠20.0g磷酸二氢钾1.4g磷酸氢二钠12.0g七叶苷1.0g蒸馏水1000mLpH7.2～7.4GB4789.30—20106A.3.2制法将上述成分加热溶解，调节pH，分装，121℃高压灭菌15min，备用。A.3.2.1李氏Ⅰ液(LB1)225mL中加入：1%萘啶酮酸(用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制)0.5mL1%吖啶黄(用无菌蒸馏水配制)0.3mLA.3.2.2李氏Ⅱ液(LB2)200mL中加入：1%萘啶酮酸0.4mL1%吖啶黄0.5mLA.4PALCAMA.4.1成分酵母膏8.0g葡萄糖0.5g七叶甙0.8g柠檬酸铁铵0.5g甘露醇10.0g酚红0.1g氯化锂15.0g酪蛋白胰酶消化物10.0g心胰酶消化物3.0g玉米淀粉1.0g肉胃酶消化物5.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mLpH7.2～7.4A.4.2制法将上述成分加热溶解，调节pH，分装，121℃高压灭菌15min，备用。A.4.2.1PALCAM选择性添加剂多粘菌素B5.0mg盐酸吖啶黄2.5mg头孢他啶10.0mg无菌蒸馏水500mLA.4.2.2制法将PALCAM基础培养基溶化后冷却到50℃，加入2mLPALCAM选择性添加剂，混匀后倾倒在无菌的平皿中，备用。A.5革兰氏染色液A.5.1结晶紫染色液A.5.1.1成分结晶紫1.0g95％乙醇20.0mL1％草酸铵水溶液80.0mLA.5.1.2制法GB4789.30—20107将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.5.2革兰氏碘液A.5.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300mLA.5.2.2制法将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.5.3沙黄复染液A.5.3.1成分沙黄0.25g95％乙醇10.0mL蒸馏水90.0mLA.5.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.5.4染色法A.5.4.1将纯培养的单个可疑菌落涂片，火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。A.5.4.2滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。A.5.4.3滴加95％乙醇脱色，约15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A.5.4.4滴加复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。A.6SIM动力培养基A.6.1成分胰胨20.0g多价胨6.0g硫酸铁铵0.2g硫代硫酸钠0.2g琼脂3.5g蒸馏水1000mLpH7.2A.6.2制法将上述各成分加热混匀，调节pH，分装小试管，121℃高压灭菌15min，备用。A.6.3试验方法挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到SIM培养基中，于30℃培养24h～48h，观察结果。A.7缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用)A.7.1成分多胨7.0g葡萄糖5.0g磷酸氢二钾5.0g蒸馏水1000mLpH7.0A.7.2制法溶化后调节pH，分装试管，每管1mL，121℃高压灭菌15min，备用。GB4789.30—20108A.7.3甲基红（MR）试验A.7.3.1甲基红试剂A.7.3.1.1成分甲基红10mg95%乙醇30mL蒸馏水20mLA.7.3.1.2制法10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸馏水。A.7.3.1.3试验方法取适量琼脂培养物接种于本培养基，36℃±1℃培养2d～5d。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。A.7.4V-P试验A.7.4.16%α-萘酚-乙醇溶液成分及制法：取α-萘酚6.0g，加无水乙醇溶解，定容至100mL。A.7.4.240%氢氧化钾溶液成分及制法：取氢氧化钾40g，加蒸馏水溶解，定容至100mL。A.7.4.3试验方法取适量琼脂培养物接种于本培养基，36℃±1℃