拉曼光谱及其在癌症检测中的应用-蔡培

宁波化工NingboChemicalIndustr2009年第1期宁波化工-32-拉曼光谱及其在癌症检测中的应用蔡培1，吴伟卿2，戎亮1(1.上海大学环境与化工学院,上海200444；2.上海双吴化工有限公司，上海200072)摘要：简述了拉曼光谱的原理、特点及应用，重点介绍了其在在癌症检测和诊断中的应用。关键词：拉曼光谱；癌症检测中图分类号：O657.37文献标识码：A1前言1.1拉曼光谱简介1928年印度实验物理学家拉曼发现了光的一种类似于康普顿效应的光散射效应，称为拉曼效应。简单地说就是光通过介质时由于入射光与分子运动之间相互作用而引起的光频率改变。拉曼因此获得1930年的诺贝尔物理学奖，成为第一个获得这一奖项并且没有接受过西方教育的亚洲人[1]。拉曼光谱昀初用的光源是聚焦的日光，后来使用汞弧灯。在随后的几十年内，由于拉曼散射光的强度很弱，激发光源（汞弧灯）的能量低等困难，它在相当长一段时间里未能真正成为一种有实际应用价值的工具。自从傅立叶变换拉曼光谱技术、表面增强拉曼光谱技术、激光共振拉曼光谱、共焦显微拉曼光谱、高温拉曼光谱技术、拉曼光谱与光导纤维技术的联用、固体光声拉曼技术、拉曼光谱与其它光谱的联用[2]等技术的出现，才使得拉曼光谱的应用范围更加广阔。目前拉曼光谱已广泛应用于材料、化工、石油、高分子、生物、环保、地质等领域。具体来说，可用于聚合物的研究、生物大分子的研究、多肽及蛋白质的构型的研究、无机物及金属配合物的研究、以及在文物考古中的应用、宝石鉴定中的应用、公安与法学样品分析中的应用、无机材料中的应用、矿床学中的应用、癌症检测中的应用等。就分析测试而言，拉曼光谱技术和红外光谱技术相配合使用可以为更加全面地研究分子的振动状态提供更多的分子结构方面的信息[3]。1.2拉曼光谱基本原理拉曼光谱是一种散射光谱，拉曼散射是光照射到物质上发生的非弹性散射所产生的。单色光束的入射光光子与分子相互作用时可发生弹性碰撞和非弹性碰撞，在弹性碰撞过程中，光子与分子间没有能量交换，光子只改变运动方向而不改变频率，这种散射过程称为瑞利散射。而在非弹性碰撞过程中,光子与分子之间发生能量交换，光子不仅仅改变运动方向，同时光子的一部分能量传递给分子，或者分子的振动和转动能量传递给光子，从而改变了光子的频率，这种散射过程称为拉曼散射。拉曼散射分为斯托克斯散射和反斯托克斯散射，通常的拉曼实验检测到的是斯托克斯散射，拉曼散射光和瑞利光的频率之差值称为拉曼位移。拉曼位移就是分子振动或转动频率，它与入射线频率无关，而与分子结构有关。每一种物质有自己的特征拉曼光谱，拉曼谱线的数目、位移值的大小和谱带的强度等都与物质分子振动和转动能级宁波化工NingboChemicalIndustry2009年第1期宁波化工-33-有关[4]。1.3拉曼光谱的特点拉曼效应普遍存在于一切分子中，无论是气态，液态和固态。拉曼散射昀突出的优点是采用光子探针，对于样品是无损伤探测，尤其适合对那些稀有或珍贵的样品进行分析，甚至可以用拉曼光谱检测活体中的生物物质[5]。拉曼光谱技术还有很多优点，如：适于分子骨架的测定，且无需制样；不受水的干扰；使用的激光光源性质使其相当易于探测微量样品，如表面、薄膜、粉末、溶液、气体和许多其他类型的样品；拉曼仪器中用的传感器都是标准的紫外、可见光器件，检测响应得非常快；单独一台拉曼光谱仪就可覆盖整个振动频率范围；拉曼光谱一般都比红外光谱简单，重叠带很少见到；可观察整个对称振动；偏振测量给拉曼光谱所得信息增加了一个额外的因素,对带的认定和结构测定是一个帮助等。拉曼光谱技术自身的这些优点使之成为现代光谱分析中重要的一员。拉曼光谱的缺点之一是会产生荧光干扰,样品一旦产生荧光,拉曼光谱会被荧光所湮灭检测不到样品的拉曼信号；二是检测灵敏度低[6]。2拉曼光谱在癌症检测中的应用2.1癌症众所周知癌症己经成为困扰人类身体健康的一个重要疾病，全球癌症的发病率20世纪下半叶比上半叶增长了近10倍,已成为威胁人类生命的第一杀手[7]。目前虽有多种方法对癌症进行诊断，但昀终确定癌症性质和程度，还是要依据病理学诊断和医生的经验，这些方法不但过程繁琐，常受人为因素影响，诊断过程还给病人带来极大的痛苦，而且确诊后大多进入了中晚期。在当前癌症临床研究中，由于癌症早期不伴转移，肿瘤容易切除，可为患者赢得较多的存活机会，因此科技界对癌症的早期诊断格外重视。研究证实肝癌肿瘤直径与手术后5年生存率密切相关，肿瘤直径2cm，5年生存率100%，肝癌肿瘤直径每增加1cm，年生存率下降20%[8]。可见如果能通过非破坏性、非侵人性的检测能早期发现癌症，对癌症的治疗具有重大意义。许多现代分析仪器如X射线透视、X射线、CT、超声波、放射性核素发射、核磁共振成像等已用于医学诊断，这些技术属于影像学，前4种不够准确，后一种能够提供生化信息，但仪器昂贵。因此，有必要发展一种创伤小、方便、准确的诊断方法[9]。2.2拉曼光谱在癌症中应用简述细胞或组织发生癌变，是由于生物分子的结构或成分发生了改变，比如DNA、脂类、蛋白质等。傅里叶变换红外光谱是一种无损、灵敏度高的分析技术，它已经广泛的应用于癌症的研究中[10]。但是，人体的组织或细胞含有大量的水分，由于水对红外光具有强烈的吸收，很难获得高分辨率、高灵敏度的红外光谱，因此红外光谱很难对组织或细胞进行原位分析。由于水的拉曼散射光谱极弱，而对于其它生物物质则带有丰富的的拉曼信息。细胞和组织是由蛋白质、核酸、糖、脂质、辅酶、维生素等成分组成的，结构复杂的生命基本单元每一种生物分子都有其对应的特征拉曼峰。拉曼光谱是一种无损、信息非常丰富的光谱技术，可以应用于固态、溶液或液态的生物分子的结构分析，并且可以直接的对生物样品，比如细胞、组织、DNA、蛋白质等进行检测不需要任何处理。因此，拉曼光谱技术在医学检测和诊断领域的应用倍受人们的重视。在肿瘤生长和发展过程中，组织细胞内的物质结构、构象和数量会发生明显变化，拉曼光谱可以对这些信息变化实现高灵敏度、高分辨率的检测，进而在分子水平上揭示癌变组织与正常细胞组织结构之间的差异，通过对比研究癌变组织和正常组织的拉曼光谱，从二者的差异可发现能反映组织病拉曼光谱及其在癌症检测中的应2009年第1期宁波化工-34-变信息的特征光谱。因此，拉曼光谱检测技术对实现癌症的早期诊断和及时治疗，从而提高癌症患者的生存几率，具有重要意义。特别是近二十年来，拉曼光谱技术得到不断的改进，已经被广泛应用于肿瘤诊断的研究中。2.3拉曼光谱技术在癌症检测和诊断中的应用举例2.3.1癌症组织实体的拉曼光谱研究组织实体是手术后的组织经过生理盐水清洗后，冰冻或放人溶液中保存起来，不再做其他处理。实验时取出来直接作为样品来进行拉曼光谱分析的。Hiroya等[11]利用近红外拉曼光谱对甲醛保存后的肺部肿瘤进行了检测，结果表明肿瘤组织的拉曼光谱在1610cm-1和1627cm-1处出现了特征峰，而且在1448cm-1和1662cm-1的强度比正常组织的明显增强。刘刚等[12]对甲状腺癌变组织和肺部瘤变组织分别进行了研究，发现甲状腺癌变组织的拉曼光谱未显示1585cm-1和1634cm-1两个谱带，而这两个谱带正是正常甲状腺组织的特殊谱带；肺部癌变组织和正常组织均未发现特征拉曼光谱峰，但二者在光谱强度上有显著区别，正常肺部组织的强度比肺部癌变组织的大得多。凌晓峰等[13]在研究胃癌时发现，正常组织和癌变组织的拉曼光谱在波数为200cm-1-3700cm-1之间,至少可以观察到8个峰，峰高之比I3240/I2940，I1660/I1450，I1080/I1450和峰面积之比A3240/A2960，A1660/A1450在癌变组织的光谱中明显升高；分析结果表明，正常组织和肿瘤组织主要差别反映在水和蛋白质的OH，NH，C=O伸缩振动谱带的强度上。相对正常组织而言，肿瘤组织的谱峰明显强于正常组织，造成这一现象的原因可能是水与蛋白相互作用及氮健结构在正常组织和肿瘤组织中不同所致。赵元黎[14]等利用显微共聚焦拉曼光谱仪检测了40例手术切除乳腺肿瘤周边(肿块边约5mm)组织的拉曼光谱。研究表明，在不同性质的乳腺肿块周边组织的拉曼光谱中，I1440/I1530和I1082/I1156具有可分性，分别以1.25和1.03作为界线可以对检测目标进行识别分类。2.3.2癌症组织病理切片的拉曼光谱研究组织病理切片是组织经过取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤而获得，组织细胞已经死亡。通过分析肿瘤组织切片的拉曼光谱来寻求诊断恶性肿瘤的方法是可行的。组织病理切片容易长期保存和获得，因此可以采用研究组织病理切片的激光拉受光谱来获得恶性肿瘤的信息。唐伟跃等[15]研究了胃部的正常组织切片和癌变组织切片的拉曼光谱，正常组织和痛变组织在883cm-1，1051cm-1，1283cm-1等附近的拉曼光谱的相对强度存在差异：1089cm-1，1459cm-1等附近的拉曼光谱的相对强度存在明显差异；癌变组织在1459cm-1处的谱线发生了分裂；分析结果得出：可用1089cm-1线和1540cm-1线对比，来鉴别肿瘤细胞和正常细胞。佟倜等[16]为了探索共聚焦激光拉曼光谱仪在检测癌组织及其癌旁正常组织的特征峰差异，提供分子在光谱水平检测组织样本共聚焦激光拉曼光谱方法，对多种鳞癌组织和正常组织进行了拉曼光谱分析，发现鳞癌组织的拉曼光谱在1200cm-1和1600cm-1出现了两个特征峰，而正常组织均未见特征峰。姚淑霞等[17]对乳腺肿瘤患者的病理切片和正常组织切片进行了卓有成效的研究，结果显示细胞核的拉曼光谱峰比较明显，癌变组织860cm-1处的拉曼峰明显蓝移，并提出了以I1610/I1525是否大于1.015作为判断乳腺组织是否癌变的标准。Choi等[18]利用共聚焦拉曼光谱技术对正常组织和基底细胞癌组织进行光谱检测研究，发现二者的光谱存在明显差异。因此，无需对光谱数据进行宁波化工NingboChemicalIndustry2009年第1期宁波化工-35-统计分析，便可以将癌变组织与周围正常组织区分开。2.3.3癌症患者血清的拉曼光谱研究血清的主要成分是水、蛋白质、无机盐和有机小分子等，主要来源于细胞分泌或者组织的降解、渗漏。血清中各种成分的改变，可以反映体内各种细胞、组织生理和病理的变化。癌变细胞或组织排泄到血液中的代谢物，势必会影响到血清的拉曼光谱，同时血清容易获取，对病人几乎没有伤害，因此，研究血液的拉曼光谱是寻求癌症早期诊断的一种重要方法。郭萍等[19]用激光拉曼光谱对正常人、鼻咽癌、肝癌患者受试者的血清在0~2000cm-1范围内进行测试，结果显示，同类患者中不同受试者血清的激光拉曼光谱特征峰大小虽然不同，但光谱图特征基本一致；不同种类癌症患者血清的激光拉曼光谱图存在较大差异；在各类癌症患者血清的激光拉曼光谱图特征峰附近，正常人血清均没有拉曼光谱特征峰。Li等[20]研究了在肺癌发展过程中血清的荧光光谱及拉曼光谱的变化，采用488nm和514.5nm作为激发光对一组癌症患者的血清每周进行一次检测，研究发现：癌症发展的不同时期荧光光谱没有明显变化，而属于β胡萝卜素的三个拉曼峰(分别位于539nm、544nm及556nm处)强度减小，昀后消失。该实验结果表明，在肺癌恶化的过程中，β胡萝卜素的含量逐渐减少，可将此作为诊断肺部是否癌变的依据。高泽红等[21]利用氩离子激光器作为光源，对乳腺癌、子宫颈癌、膀胱癌、胰腺癌、食管癌、胃癌患者的血清和正常人的血清进行了拉曼光谱检测，结果表明：正常人血清由4880nm波长的单色光激发的拉曼光谱的相对强度，小于由5145nm波长的单色光激发的拉曼光谱的相对强度；癌症患者血清由4880nm波长的单色光激发的拉曼光谱的相对强度，大于由5145nm波长的单色光激发的拉曼光谱的相对强度；正常人与癌症患者血清拉曼光谱存在差异。从而从分子水平探讨了正常人和癌症患者血清中代谢产物存在差异的信息。2.3.4癌症单细