分子发光荧光磷光和化学发光法

第五章分子发光—荧光、磷光和化学发光法分析化学（仪器分析部分）你知道下面的发光原理吗？•磷火（鬼火）•荧光棒•萤火虫分子发光molecularluminescence•分子荧光•分子磷光•化学发光•生物发光光致发光：分子吸收了光能而被激发至较高能态，在返回基态时，发射出与吸收光波长相等或不等的辐射，这种现象称为光致发光。化学发光：化学反应中，产物分子吸收了反应过程中释放的化学能而被激发，在返回基态时发出光辐射。目录5-1荧光和磷光光谱法5-2化学发光与生物发光分析法参考文献：•陈国珍，黄贤智，郑本梓，许金钩，王尊本，荧光分析法，科学出版社，北京，1990•JosephR.Lakowicz,PrincipleofFluorescenceSpectroscopy,KluwerAcademic/PlenumPublishers,NewYork,1999•netLibrary电子图书目录5-1荧光和磷光光谱法5-1-1基本原理5-1-2荧光分析仪器5-1-3荧光分析方法的特点与应用5-1-4磷光分析法5-2化学发光与生物发光分析法5-1-1基本原理5-1-1-1荧光和磷光的产生5-1-1-2光谱曲线5-1-1-3荧光的影响因素5-1-1-4荧光强度的定量关系基态单重态S0激发态单重态S激发态三重态T10-8s10-4-1s5-1-1-1荧光和磷光的产生1．单重态和三重态基态单重态(singletstate)：自旋电子成对,只有一种自旋方向(相反)↑↓,电子自旋总和是零，光谱项的多重性是1，以S0表示;当基态电子激发到某高能级时,将有两种激发态：即受激电子自旋相反与自旋平行:↑↓h、↑↑h。自旋平行多重性为M=2x1+1=3，称为激受三重态（tripletstate）用T表示，自旋相反多重性为1，称为激受单重态，用S表示；激发单重态S与激发三重态T的不同点：⑷激发三重态的能量较激发单重态的能量低。⑶基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁；⑵tS=10-8s,tT=10-4～1s；⑴S是抗磁分子，T是顺磁分子；2．分子内的光物理过程辐射跃迁：荧光：S1最低振动能级—S0磷光：S——T非辐射跃迁：(热的形式)振动弛豫内转移外转移系间窜跃系间窜跃内转移荧光的寿命比磷光的寿命短，但是量子产率较高。非辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。内转换：相同多重态电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间窜跃：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。辐射能量传递过程荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态，多为S1→S0跃迁，发射波长为‘2的荧光；10-7～10-9s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；‘221；磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态，T1→S0跃迁；电子由S0进入T1的可能过程：（S0→T1禁阻跃迁）S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1发光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持续一段时间。5-1-1-2光谱曲线激发光谱发射光谱磷光光谱（phosphorescence）特征：（1）Stokes位移（2）激发波长一般不影响发射光谱的形状（3）吸收光谱与发射光谱的镜像关系激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如‘2)。c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。镜像规则的解释基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。5-1-1-3荧光的影响因素1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。量子产率:荧光物质发射光子数与吸收激发光子数之比（当非辐射跃迁A返回基态的概率很小时，F接近于1，在通常情况下，F总是小于1的）吸收激发光的量子数发出荧光的量子数F2．荧光与有机化合物的结构（1）跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；*→跃迁是产生荧光的主要类型.（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移易于实现*→跃迁的芳香族化合物容易发出荧光,而脂肪族和脂环族化合物(除少数高度共轭体系化合物以外)极少能发生荧光.（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。金属螯合物的荧光：不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构增大，常会发出荧光。（4）取代基效应：芳环上有给电子基团，使荧光增强。—OH、—CN、—NR2、—OR、—NH2芳环上有吸电子基团，使荧光减弱甚至猝灭。—C—O、—NO2、—NO、—COOH、卤素离子苯酚、苯、硝基苯、苯甲酸中，产生荧光最强的是__________。3．溶剂效应同一种荧光物质溶于不同溶剂，其荧光光谱的位置和强度可能有明显不同。一般情况下，随着溶剂的极性的增加，荧光物质的π→π*跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移。4．温度的影响一般说来，大多数荧光物质的溶液随着温度的降低，荧光效率和荧光强度将增加，相反，温度升高荧光效率将下降。如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光效率增加3%，冷至-80℃时，荧光效率为100%。•分子碰撞•能量转移•O2的作用•内滤效应•自熄灭、自吸收5．荧光熄灭（猝灭）Wavelength(nm)350400450500550600650700750800Absorbance0.00.20.40.60.81.0FluorescenceIntensity0102030405060abcdFluorescencespectra(-)ofTPPandabsorptionspectra(---)ofETH5294inplasticizedPVCmembrane:a.ExcitationspectrumofTPP;b.EmissionspectrumofTPP;c.UnprotonatedETH5294;d.ProtonatedETH5294.荧光物质分子与溶剂或其它溶质分子相互作用，引起荧光强度降低、消失或荧光强度与浓度不呈现线性关系的现象。5-1-1-4荧光强度的定量关系FkIclclclF23123223302.[(.)/!(.)/!]k与仪器有关的常数I0激发光的强度F荧光量子产率荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数l光程长度。根据Parker方程，荧光强度F与荧光物质的浓度c之间的关系是：当cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均可忽略不计，Parker方程可简化为：FkIclF230.F=Kc5-1-2-1荧光分析仪器框图光源激发光单色器样品池发射光单色器(荧光单色器)检测器信号处理显示I0FIt消除溶液中可能共存的其它光线的干扰,以获得所需要的荧光.5-1-2荧光分析仪器4-2-1紫外-可见分光光度计的基本组成光源单色器样品室检测器显示可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。紫外区：氢、氘灯。发射185～400nm的连续光谱。5-1-2-2荧光分光光度计部件1．光源：氙灯激发光源应具有稳定性好、强度大、适用波长范围宽等特点。其中稳定性：影响测定的重现性和精密度；强度：影响测定的灵敏度。2．单色器：滤光片、光栅激发单色器和发射单色器3．检测器PMTPhotomultiplierCCDChargeCoupledDeviceCIDChargeInjectedDevice4．信号处理•灵敏度高：比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；检测下限：0.1～0.1ug/cm-3相对灵敏度：0.05-0.005ppb（0.05MH2SO4)•选择性高•重现性好•取样量少•仪器不复杂5-1-3荧光分析方法的特点及应用1．特点2．应用•检测：金属离子、有机物、生物分子•生物分子相互作用研究•疾病诊断定性分析：依据不同结构的物质所发射的荧光波长不同；定量分析：同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度呈线性关系。1．如何获得较强的磷光•增加试样的刚性•固体磷光法•分子缔合物的形成•重原子效应•敏化磷光5-1-4磷光分析法分子的外层电子在辐射能的照射下，吸收能量跃迁至激发态，再以无辐射驰豫转入第一激发三重态的最低振动能级，然后跃回基态的各个振动能级，并产生辐射。这种发光现象称为磷光。目录5-1荧光和磷光光谱法5-2化学与生物发光分析法5-2-1基本原理5-2-2化学与生物发光分析的应用5-2-1基本原理1.化学发光反应（chemiluminescence）在化学反应过程中，某些化合物吸收了反应时产生的化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。A+B→C*+DC*→C+h（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学反应必须能够提供足够的能量，以引起电子激发。化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当E=150～400kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；化学发光反应如果存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光（bioluminescence）。2.化学发光效率化学效率：emcecl参加反应的分子数发射光子的分子数参加反应分子数激发态分子数ce发光效率：激发态分子数产生光子数em时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：tctIddclcldc/dt分析物参加反应的速率；3.化学发光强度与化学发光分析的依据在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂少得多，对于一级动力学反应：cttcttIAttcl0cl0cldddddc/dt=Kc；K为反应速率常数。定性依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：4.化学发光反应的类型（1）气相化学发光反应a.一氧化氮与O3的发光反应(可测定空气中NO2的含量）NO+O3→NO2*NO2*→NO2+h发射的光谱范围：600～875nm，灵敏度1ng/mL；b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应O3→O2+O（1000C石英管中进行）SO2+O+O→SO2*+O2SO2*→SO2*+h最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/mL；O3→O2+O（1000C石英管中进行）NO+O→NO2*NO2*→NO2+h发射光谱范围：400～1400nm；灵敏度1ng/mL；氧原子与CO的发光反应：CO+O→CO2*CO2*→CO2+h发射光谱范围：300～500nm；灵敏度1ng/mL；氧原子与NO的发光反应：c.乙烯与O3的发光反应乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：CH2O*→CH2O+h最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1ng/mL～1g/mL；（2）液相中的化学发光反应应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：最大发射波长：425nm可检测低至10-9mol/L的H2O2；•鲁米诺-