酵母菌育种研究与应用前景

酵母菌育种研究及应用前景殷文政前言酵母菌与人类的关系源远流长，8000年前，人们利用酵母菌制作面包、酿造葡萄酒、啤酒和清酒等。20世纪末，酵母菌已作为一种模式生物在生物化学、遗传学和分子生物学等方面担任了重要的角色。自从1978年建立酵母菌遗传转化技术以来，酵母菌已成为生产异源蛋白及其生物学分析方面最有用的真核微生物。酵母菌的生物学研究取得了巨大的进展：1996年完成了酿酒酵母菌全基因组的序列测定。已建立了相关的数据库，如酿酒酵母基因组数据库（SGD），酵母蛋白质组数据库（YPD）等，数据库容纳了有关酵母菌的6000多个基因及其蛋白质功能、结构和相互间的关系等大量信息。随着酵母菌的生物学研究的深入发展，对酵母菌的应用开发研究及优良酵母菌的选育也一直倍受关注，已有众多的具有不同优良特性的酵母菌株问世，并造福于人类。本文简要概述工业用酵母菌的育种研究概况及应用前景。一、酵母菌的地位酵母菌是人类的朋友少数酵母菌属于致病菌二、酵母菌的功能自然界生物链中的一员发酵工业（面包、啤酒、酒精、醇类、酶类、核酸、有机酸、氨基酸、维生素、多糖、及多种代谢产物等）食品及保健品工业医药工业（新药）环境保护饲料工业农业遗传学研究的模式材料、外源蛋白表达的受体系统新的功能？三、酵母菌选育的相关技术及方法1自然筛选2诱变育种3杂交育种4原生质体融合育种5分子育种（基因工程技术）自然筛选从自然界中分离筛选；从收集到的不同来源的工业用酵母菌筛选符合厂家生产需要的酵母菌种；从生产中分离符合需要的工业用酵母菌种等。诱变育种物理因子：UV、X、、快中子、高温等；化学因子：亚硝酸、NTG、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、5-氨基尿嘧啶等；对工业用酵母菌细胞进行诱变处理，依据需要，筛选具有优良特性的工业用酵母菌种。杂交育种细胞X细胞细胞X孢子孢子X孢子获得具有优良特性的工业用酵母菌种1原生质体融合育种原生质体＋原生质体原生质体＋灭活原生质体细胞器＋原生质体融合异源细胞＋酵母原生质体获得具有优良特性的工业用酵母菌种分子育种（基因工程技术育种）分子育种（基因工程技术育种）主要包括以下几种技术：异源基因在工业啤酒酵母中的克隆和表达同源基因在工业啤酒酵母中的克隆和表达（自克隆技术）基因敲出增加有用基因的考贝数细胞表面展示技术依据其代谢途径进行基因的重新组合四、国内外有关工业用酵母菌的育种研究概况国内外有关酵母菌的育种研究，主要是酵母菌的分子育种（即基因工程技术育种）概况。1、通过自然筛选获得生产需要的酵母菌种主要有两种方法：一是从收集到的不同来源的工业用酵母菌中筛选符生产需要的菌种；二是从生产中通过分离、纯化获得符合需要的酵母菌种。2、采用物理或化学因子对生产用酵母菌进行诱变处理，筛选具有优良特性的酵母菌种Alikhangan等人用UV照射和EDS诱变啤酒酵母,使酵母菌的乙醇耐受性从14.1%提高到17.5%。贺家明等人用γ和UV射线对嘉士伯啤酒酵母进行诱变，使其耐糖度从24°提高到28°,耐乙醇性能8.25%(m/m)提高到9.45%(m/m)、发酵度从14°提高到18°，而且性能稳定。唐晓达等人采用EMS对啤酒酿造生产菌株FB进行诱变，从突变株中筛选分离到一株发酵液中双乙酰含量比亲株降低了42.7%。菌株的其它发酵性能的测定结果表明其保持了亲株的优良性状，且遗传性状稳定。施碧红等采用UV及硫酸二乙酯对一株富含谷胱甘肽（GSH）的酵母菌株，进行复合诱变，以甲硫氨酸缺陷型为筛选模型，获得一株高产谷胱甘肽的突变株M-05，其每g干细胞含GSH14.43mg。比亲株提高了68.4%。刘娟等通过自然筛选、单倍体分离、诱变及融合等技术，选育到高产GSH酵母菌株。宋安东等采用离子注入技术对苹果酒酵母菌进行诱变育种研究，获得一株酒精产率较高的突变菌株，酒精产率比亲株提高了10.7%。胡卫红等应用红外CO2激光对酿酒酵母进行辐照处理，并初步筛选到产乙醇含量有较大变化的辐照变异菌株。李红民等人采用激光对面包酵母菌进行诱变处理，筛选到3株低糖面团起发活力大幅度提高的菌株XD198、XD193和XD174，其低糖团起发活力比出发菌株分别提高31.3%、32.7%和35.3%,海藻糖含量分别较出发菌株提高1.37%、10.83%、5.10%。而且筛选到的高活力菌株遗传性能稳定，证明激光诱变效果明显，是进行面包酵母菌种选育的理想方法之一。刘玉方等人用s-(β-氨基乙基)L-半胱氨酸（SAEC）处理一株能积累赖氨酸的酿酒酵母S1，筛选得到SAEC抗性突变株。再经二次紫外诱变，选得7株SAECc突变株，其中3株具有较高积累赖氨酸能力，并对其培养条件进行了研究。突变株MSU1的游离赖氨酸含量为菌株干重的7.83%,而突变株MSU5平均赖氨酸含量可达8.91%。3、采用杂交育种技术选育具有优良特性的工业用酵母菌种由于工业用酵母菌一般是二倍体或多倍体，只产生少量孢子或不产孢子。因此采用杂交育种技术选育具有优良特性的工业用酵母菌种的研究不多。Castillo等用对7%乙醇敏感的啤酒酵母LS2和可在12%（V/V）乙醇中生长的啤酒酵母LA1进行杂交，获得的LS5、6C等杂交菌株可产生14.11%(V/V)的乙醇。嗜杀酵母的细胞质中带有嗜杀因子，该因子为存在于Saccharomyces属的细胞质内的双股RNA，它可杀死其它种属酵母。Haben等通过强迫交配法将嗜杀酵母的嗜杀因子导入啤酒酵母的细胞中，使啤酒酵母具有嗜杀因子，则可防止其它酵母的污染。蔡金科等用显微操作技术进行ScerevisiaeЯ系2.576(mel-)与S.carlsbergensis2.500(MEL+)以及S.cerevisiaeStole系列化（mel-）与S.microellspsoides2.699-2-3(MEL+)进行种间杂交。获得的杂种生成酒精量比其亲株高3-10%。蔡金科等用显微操作技术对啤酒酵母（Scerevisiae)不同品系进行杂交，从不同杂交组合中选出五株杂种菌株，在甜菜糖蜜培养基中所有杂种的生物量比工业生产菌Y26提高20%-30%。张博润等采用常规筛选方法，经单倍体分离、MNNG诱变和群体杂交等手段，从中选育出一株细胞生物量略高于实验出发菌、超氧物歧化酶高达1350U/g湿菌体的SOD高产菌株。刘青等采用杂交育种技术选育到在不同含糖量（0-30%）面团中都具有高发酵力的高适应性的优良面包酵母菌株。4、采用原生质体融合技术选育优良的工业用酵母菌种原生质体融合技术克服了杂交不易交配及产孢的局限，加之工业用酵母菌多为多倍体或非整倍体，用原生质体融合很适合于工业用酵母菌的改良。日本三井造船株式会社用具有絮凝性、可生成约11%乙醇的酵母TJ1菌株与具有耐高温、耐乙醇、无絮凝的酿酒酵母N1菌株进行融合，获得的融合株AM12具有双亲特性，可生成20%的乙醇。朱文深等采用原生质体融合技术获得的融合株1400具有分解糊精的能力，可比双亲产生更高浓度的乙醇。刘春秀等采用原生质体融合技术，将具有强絮凝特性的清酒酵母与工业用啤酒酵母进行融合，获得具有强絮凝特性的工业用啤酒酵母菌株。郭雪娜等采用原生质体融合技术，将发酵速度快的啤酒酵母与青岛啤酒酵母进行融合，通过筛选，获得优良的啤酒酵母菌株。张博润等采用原生质体融合技术将酒精酵母（Saccharomycescerevisiae2.576-7αtrpadeMAL+lac-)和乳酸克鲁维酵母（KluyveromyceslactisZW-14αhismal-LAC+)进行属间原生质体融合，获得强发酵乳糖的融合子，在以乳糖为碳源的培养基中，融合体的乙醇产率是亲株乳酸克鲁维酵母的乙醇产率的2.5倍。张博润等通过筛选、单倍体分离、诱变及酵母菌种间原生质体融合技术构建了2株麦角固醇产量明显提高的优良菌株YEF-21和YEF-29。5、分子育种技术选育具有优良性状的工业用酵母菌种1）实验室酵母菌和工业用酵母菌的差异绝大部分实验室酵母菌是从工业酵母菌衍生而来的。但是，经过单倍体分离、诱变处理后，使得实验酵母菌通常具有其以下特征：通常是单倍体，具有a或α交配型；具同源基因型；二倍体化时具有生孢能力；一般具有营养缺陷标记，如leu2、lys2、ura3、his3、met15、trp1等。实验室酵母菌的上述特征是进行酵母菌遗传学、酵母菌分子生物学及基因克隆和表达研究所必需的。工业酵母菌的主要特征是：一般是二倍体或多倍体，只产生少量孢子或不产生孢子；具异源基因型；不具有营养缺陷标记，即原养型。但是，工业酵母菌在风味食品和饮料等生产中具有其优越的性能。2）用于工业酵母菌分子育种的转化系统载体在工业酵母菌的分子育种中使用的载体主要有：酵母菌整合载体（YIp）、酵母菌着丝粒载体（YCp）和酵母菌附加体质粒载体YEp。YCp和YEp载体可以在工业酵母细胞中复制，转化率比YIp载体高。YIp载体转化时必须要插入到染色体上，因此转化率低，但转化子的遗传稳定性高。一些选择标记的转化率只在YCp或YEp载体上检验过，进一步用YIp载体进行这些选择标记的转化实验，对于工业酵母菌的分子育种是很有用的。选择标记营养缺陷标记：由于工业酵母菌是二倍体或多倍体，通常难以获得稳定的营养缺陷突变株。因此很少使用营养缺陷标记。至今仅有URA3、TRP1和ECM31三种营养缺陷标记用于工业酵母菌的分子育种。上述三种营养缺陷标记仅使用于相对应的突变株的转化系统。药物抗性标记：与营养缺陷标记不同，药物抗性标记的优势在于不要求作为转化用的酵母菌有任何突变，因此，有不少药物可作为工业酵母分子育种的抗药性标记。工业酵母菌的分子育种的转化系统中使用的许多抗性标记药物是抗代谢物。例如当使用浅蓝菌素作为选择药物时PFKp-YAP1的转化率较高，而使用放线菌酮作为选择药物时PFKp-YAP1的转化率就较低。这可能是筛选时选择的药物对酵母细胞的毒性作用而影响转化率。使用药物抗性标记时常会出现背景菌落。如果筛选使用的药物浓度低，非转化子背景菌落增加，转化率也增加。反之，提高药物浓度，会减少背景菌落，但转化率也相应降低。要解决这个问题，选用具有复合药物抗性标记非常有用。PFKp-YAP1抗浅蓝菌素和放线菌酮，对其它药物敏感；几乎所有能够在浅蓝菌素平皿上生长的背景菌落都对放线菌酮敏感。因此很容易将对浅蓝菌素和放线菌酮具有双重抗性的真正的转化子与只仅有浅蓝菌素抗性的背景菌落区分开。3）工业酵母工程菌细胞内不需要基因的敲除在进行工业酵母菌的分子育种时，为了有效筛选转化子，使用选择标记是十分必要的。但将这些含有大肠杆菌抗生素抗性标记和酵母菌抗药性标记的工业酵母重组菌用于食品和酿造工业，其安全性问题必需考虑。因此，敲除工业酵母重组菌细胞内中不需要的基因是商业化使用这些工业酵母重组菌必须要解决的问题。敲除基因的筛选被称为反选择。目前已用于敲除工业酵母重组菌细胞内中不需要的基因的反选择技术有以下三种ura3/5-FOA反选择技术属于这种反选择技术还包括：LYS2，CAN1，CYH2，GAP1，MET15和TRP等标记基因，使用这些反选择标记时要求受体菌的相应基因是隐性突变。目前只有URA3标记基因已用于工业酵母菌的遗传操纵体系，其他几种反选择标记仅用于实验室酵母菌，还未在工业酵母菌遗传操纵体系中应用。颜色指示和rDNA重组反选择技术Fujii等利用重组整合载体将α-乙酰乳酸脱羧酶基因与大肠杆菌lacZ基因一起整合到酵母rDNA区域。利用在rDNA区域高频率的自发重组特性及lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶，通过观察lacZ编码的β-半乳糖苷酶致使细胞呈蓝颜色来筛选不需要的DNA序列已被敲出的转化子。GALp-GIN11反选择技术GALp-GIN11反选择标记包括可诱导高量表达启动子GALp和生长抑制序列GIN11。当生长抑制处于阻遏状态时，细胞能正常生长，但当生长抑制基因受到诱导高量表达时，含有标记基因的细胞无法生长，而丢失标记基因的细胞则能够生长。该反选择标记的主要优点在于不再要