生物分离工程论文

合肥学院HefeiUniversity生物分离工程论文题目:高压均质与酶法相结合破碎裂殖壶菌系别:专业班级:_学号:姓名:指导教师:2015年11月22日生物分离工程论文高压均质与酶法相结合破碎裂殖壶菌摘要：裂殖壶菌是一种理想的DHA的新生资源。其合成的DHA位于胞内，因此为了获得DHA，需要对裂殖壶菌细胞进行破碎，但是目前的破碎方法效率不高。本试验采用高压均质与酶法相结合的方法来破碎裂殖壶菌。结果表明在50MPa下高压均质两次后，添加1.5%的碱性蛋白酶，在pH为10，温度为550C条件下，酶解1.5h后裂殖壶菌破碎率可达96.6%。因此，该复合法相比单一的高压均质破碎显著提高了裂殖壶菌破碎率。关键词:裂殖壶菌;高压均质:酶法破碎;细胞破碎率裂殖壶菌(Schizochytrium)是属于真菌门、卵菌纲、水霉目、破囊壶菌科的一类类藻的海洋真菌。该菌细胞内积累了大量的油脂，90%以上的油脂以人体易吸收的中性油脂一甘油三脂CTG)的形式存在[1]总脂肪酸中不饱和脂肪酸含量很高，主要为二十二碳六烯酸(DHA，Docosahexaenoicacid,C22:6,n-3)和另外一种n-6PUFA(polyunsahzratedfattyacids)，其中DHA占总脂肪酸的30%~50%左右。近年来，作为重要的n-3PUFA之一的DHA因其具有重要的生理意义和经济价值而倍受人们的青睐。研究表明，它不仅是婴幼儿大脑和视觉正常发育的必需物质[2]，而且还具有治疗心血管疾病，抑制肿瘤及提高免疫力等多种重要的生理功能[3-5]。随着渔业资源的日益紧张和生物技术的发展，DHA的生产方式也实现了从传统的鱼油提取向微生物发酵生产的转变。作为DHA新生资源之一的裂殖壶菌DHA含量高，生长快，易于培养，对人畜无害，其生产的富含DHA的单细胞油脂能够应用于食品、化妆品、饲料添加剂以及保健品等领域，具有极高的经济价值。本试验采用高压均质与酶法相结合的方法破碎裂殖壶菌，先利用高压均质破坏细胞壁结构，降低细胞壁的机械强度，消除酶与底物的空间位阻，然后采用酶法处理，旨在找到高效，经济的细胞破碎方法，来提高DHA油脂的产量与质量，降低生产成本，为DHA的工业化生产提供相应的技术支持。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种裂殖壶菌:实验室保藏。生物分离工程论文1.1.2培养基固体培养基(GYP培养基):葡萄糖2%，蛋白陈1%，酵母粉0.5%，海水晶2%。种子培养基:葡萄糖3%，酵母粉1%，海水晶2%。发酵培养基:葡萄糖13%，酵母粉0.3%，玉米浆0.7%，海水晶2%，硫酸按0.2%，磷酸二氢钾0.4%。1.1.3试剂纤维素酶(酶活:10X104--140X104U/g)，中J哇蛋白酶(酶活:20X104U/g)，碱性蛋白酶(酶活:20X104--150X104U/g)，木瓜蛋白酶(酶活:6X104--150X104U/g)和糖化酶(酶活:20X104U/g):购于南宁东恒华道生物科技有限责任公司。1.2主要仪器设备HYQ一150S型全温摇床:武汉汇诚生物科技有限公司;80-2离心机:常州国华电器有限公司;BM100型光学显微镜:南京江南永新光学有限公司;SHP60-80高压均质机:上海科司大均质机电设备有限公司;SHZ-22水浴恒温振荡器:太仓市医疗器械厂。1.3试验方法1.3.1裂殖壶菌的培养菌种活化:将保藏于一80℃的菌种转接于斜而，25℃培养3d进行活化。一级种子:用接种环挑取活化的菌种，接入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶，置于摇床上，25℃200响in培养48h;二级种子:取5mL的一级种子，接入装有100mL种子培养基的500mL三角瓶，25℃，200响in培养48h，然后按10%的接种量接种到发酵培养基中，25℃，200r/min培养7d。离心收集裂殖壶菌菌体，然后加入一定量的无菌水，制成浓缩液，冷藏备用。1.3.2生物量的测定干重法。1.3.3细胞破碎方法生物分离工程论文取100mL裂殖壶菌浓缩发酵液，加等体积的水混匀后置于均质机中均质两次，然后将均质后的发酵液恒温水浴，用1mol/L的NaOH调节pH，加入适量酶，振荡酶解一定时间。1.3.4破碎率的计算细胞计数法:利用显微镜，通过血球计数板计算出反应前后细胞数即可。在血球计数时细胞基本保持完整，记为一个;细胞正处于破壁阶段，记为半个;细胞基本破壁完成，不计数。以此标准来计算破壁率。破壁率=(1-A/B)X100%（1）其中A为破碎后的细胞数，B为原始细胞数。2结果与分析2.1不同均质压力下酶处理对细胞破碎的影响取6份100mL裂殖壶菌浓缩发酵液，分别加等体积的水混匀，按表1所示分别对其进行细胞破碎，选取碱性蛋白酶进行酶处理，酶用量为生物量的1%,调节发酵液pH为10,50℃恒温水浴，中速振荡酶解2h,酶解结束后计算破碎率。由表1可知，相比于单一的高压均质破碎细胞，高压均质与酶法相结合破碎裂殖壶菌可以使细胞破碎程度更彻底，在50MPa下高压均质后用碱性蛋白酶处理，破碎率比单一的高压均质破碎细胞提高了25.4%，而在30MPa和70MPa下，细胞破碎率分别提高了17.5%和22.7%。此外细胞破碎率随均质压力的升高而增大，但70MPa下的破碎率只比50MPa增加了3.2%。综合考虑高压均质处理的压力和机器磨损，本试验采用50MPa的均质压力。2.2不同种类的酶对细胞破碎的影响裂殖壶菌是海洋真菌，其细胞壁主要成分为多糖、蛋白质和脂质等。因此本试验选用纤维素酶(1)，碱性蛋白酶(2)，中性蛋白酶(3)，木瓜蛋白酶(4)和糖化酶(5)来考察不同种类的酶对细胞破碎的影响。将上述五种酶按1%的添加量分别加入到50MPa下均质两次后的发酵液中，在各自最适宜的条件下酶解2h后计算破碎率。2.3复合酶法与单一酶法破碎效果的比较生物分离工程论文选取细胞破碎效果较好的碱性蛋白酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶中的一种或几种酶为主体酶，以纤维素酶和葡聚糖酶为辅助酶按表2所示进行组合，选择合适的酶解条件，对50MPa下均质两次后的发酵液进行复合酶试验。用酶总量为1%。将碱性蛋白酶单一处理做为对照，六组复合酶的处理与碱性蛋白酶单一处理对裂殖壶菌细胞破碎程度进行比较。对比得知，除组合2破碎率高达93%外，各复合酶组合破碎效果差异不显著，并且都低于碱性蛋白酶单一处理的破碎率。这可能由于酶也是蛋白质，酶与酶之间的相互作用会降低其他酶的活性，并且不同的酶最适的pH和温度并不相同的缘故。组合2复合酶处理裂殖壶菌的破碎率仅比碱性蛋白酶单一处理的破碎率高1%，碱性蛋白酶为工业上最常用的蛋白酶，来源丰富，价格低廉。因此本研究选用碱性蛋白酶为试验所用酶。3结论以裂殖壶菌细胞破碎率来衡量细胞破碎效果，对高压均质与酶法相结合的方法和高压均质单一破碎进行比较，得到该复合法能显著提高细胞破碎率，试验结果表明，裂殖壶菌发酵液经过50MPa均质后再酶解，破碎率相比高压均质单一破碎细胞可提高25.4%。研究了不同的酶对细胞破碎效果的影响，并比较了复合酶对于单一酶的破碎效果，综合考虑选用单一碱性蛋白酶为水解酶。采用正交试验设计对50MPa均质后发酵液的酶解条件进行了选择优化。试验结果表明，酶解反应的4个因素的主次顺序为酶解温度酶解时间酶用量pH，最优的酶解反应条件为酶解温度55℃，pH10,酶用量1.5%、酶解时间1.5h，在此酶解条件下裂殖壶菌破碎率可达96.6%。该试验从节约生产成本，降低能耗，提高细胞破碎率的角度出发，对工业化破碎裂殖壶菌生产DHA油脂起到一定的参考作用。生物分离工程论文参考文献[1]肖玫，欧志强.深海鱼油中两种脂肪酸(EPA和DHA)的生理功效及机理的研究进展[J].食品科学，2005,26(8):522-526.[2]延平，苏宜香.a一3多小饱和脂肪酸影响炎症及免疫分子机制研究进[J].现代免疫学，2004,24(6):517-519.[3]崔丁维，胡学超，包姗姗，等.酶法破碎微生物细胞的研究[J].微生物学通报，2010,37(11):1672-1678.[4]湖北福星生物科技有限公司.用裂殖壶菌发酵生产二十二碳六烯酸的方法:中国，101519676A[P].2009-09-02.[5]徐栋，土春维.高压均质与酶法破碎酵母细胞壁的工艺条件研究[J].饲料工业，2009,30(12):44-47.