HCV分子生物学

HCV1、HCV生物学特征2、发病机理3、丙肝的诊断方法4、丙肝防治原则5、HCV传播途径HCV生物学特征丙型肝炎由丙型肝炎病毒（HCV）感染所致，主要由血液/体液传播。据世界卫生组织估计，全球有1.7亿人感染HCV。在我国健康人群抗HCV阳性率为0.7%~3.1%，约3800万人。由于病毒生物学特点和宿主免疫功能等多方面因素，机体免疫往往难以有效清除病毒，致使约50%~80%HCV感染者发展为慢性肝炎，其中20%~30%将发展成肝硬化。肝硬化患者中每年有1%~4%发展成为肝细胞癌症。HCV病毒体呈球形，直径小于80nm（在肝细胞中为36～40nm，在血液中为36-62nm），为单股正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有刺突。HCV仅有Huh7,Huh7.5,Huh7.5.1三种体外细胞培养系统，黑猩猩可感染HCV，但症状较轻。HCV生物学特征HCV－RNA大约有9500－10000bp组成，5′3′非编码区（NCR）分别有319-341bp，和27-55bp，含有几个顺向和反向重复序列，可能与基因复制有关。在5′非编码区下游紧接一开放的阅读框（ORF），其中基因组排列顺序为5'-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3，能编码一长3014个氨基酸的多聚蛋白前体，可经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成各自独立病毒蛋白，即三种结构蛋白，核衣壳蛋白（或称核心蛋白，C）和（E1），（E2/NS1）的糖蛋白，非结构蛋白分别与NS2、NS3、NS4、NS5相对应。由于GP72正好与瘟病毒表面蛋白或黄病毒第一个非结构蛋白（NS1）相对应，故将GP72的基因标记称谓E2/NS1。E1和E2/NS1糖蛋白能产生抗HCV的中和作用。NS2和NS4的功能还不清楚，发现与细胞膜紧密结合在一起。NS3蛋白具有螺旋酶活性，参与解旋HCV-RNA分子，以协助RNA复制，NS5有依赖于RNA的聚合酶活性，参与HCV基因组复制。Ｅ１和Ｅ２是ＨＣＶ的包膜蛋白，其中Ｅ２对病毒的入胞过程很重要，它可以与宿主细胞因子ＣＤ８１和ＳＲ－ＢＩ结合，并可以逃避宿主免疫应答。Ｅ１的作用还不是完全清楚，但有研究发现Ｅ１对ＨＣＶ与细胞受体结合、膜融合过程起一个调节作用，也是抗病毒的一个潜在的靶点。HCV变异性HCV具有显著异源性和高度可变性，对已知全部基因组序列的HCV株进行分析比较其核苷酸和氨基酸序列存在较大差异。并表现HCV基因组各部位的变异程度不相一致，如5‘-NCR最保守，同源性在92-100%，而3′NCR区变异程度较高，在HCV的编码基因中，C区最保守、非结构（NS）区次之，编码囊膜蛋白E2/NS1可变性最高称为高可变区。丙肝病毒是RNA，RNA病毒的变异速度比DNA病毒快100万倍，而且RNA病毒的外形也经常改变，这就使得丙肝等RNA病毒的疫苗很难研制。HCV基因分型①测序法：通过PCR扩增有代表性的基因片段（如5‘-UTR、C-E1和NS5B），再进行核苷酸序列测定，此为HCV基因分型的“金标准”。②型特异性引物扩增：根据不同HCV基因型在某一区段（主要是保守区）序列的差异，设计一系列型特异性引物，不同HCV基因型可扩增出长度大小不同的片段，并以此分型。③型特异性探针杂交法：通过将生物素或荧光素标记型特异性探针固相化在膜或芯片上，与实时定量（real-time,RT）-PCR扩增的病毒产物进行杂交后，经扫描判读出HCV基因型。用于该分型方法的区段是5‘-UTR及Core区。④基因芯片法：将许多特定的寡核苷酸片断作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一个探针上的荧光信号进行分析比较，从而迅速得出需要的信息。HCV基因分型⑤限制性片段长度多态性法：利用限制性酶识别RT-PCR扩增的特定区域（5‘-UTR、C-E1和NS5B）的型特异的切割位点，将其分解为长短不同的若干片段以确定分型，该方法常用酶为HaeⅢ、RsaⅠ、MvaⅠ、HinfⅠ及ScrfⅠ，利用这些酶可分开6个基因型。对于病毒基因型而言，与其他基因型相比，基因3型的CHC患者肝纤维化进展速度较快。现知欧美国家多数HCV-Ⅰ型感染，而亚洲国家以Ⅱ型为主，Ⅲ型次之。Okomoto报告日本慢性丙型肝炎患者和健康献血员主要为Ⅱ型感染，分别占59.3%和82.4%,而血友病人约50%为Ⅰ型感染,原因是应用输入美国进口凝因子Ⅷ。Wang氏报告我国北京慢性丙型肝炎患者86.2%为Ⅱ型感染,Ⅲ型感染为13.8%。而新疆病人Ⅲ型感染却占50%,说明不同型HCV具有一定的地区和人群分布特征。此外不同基因型感染引起临床过程和干扰素治疗反应亦表现不同,如Ⅲ型感染临床症状较重,有引起严惩肝病倾向:Ⅱ型(Simmonds1b)感染对干扰素治疗不敏感效果差。Ⅲ型感染(Simononds2a)用干扰素治疗效果好。HCV分布1型全球分布2型全球分布3型全球分布4型全球分布5型全球分布6型全球分布7型全球分布HCV起源HCV发病机理丙型肝炎发病机理仍未十分清楚，当HCV在肝细胞内复制引起肝细胞结构和功能改变或干扰肝细胞蛋白合成，可造成肝细胞变性坏死，表明HCV直接损害肝脏，导致发病起一定作用。但多数学者认为细胞免疫病理反应可能起重要作用，发现丙型肝炎与乙型肝炎一样，其组织浸润细胞以CD3+为主，细胞毒T细胞（TC）特异攻击HCV感染的靶细胞，可引起肝细胞损伤。丙型肝炎病毒感染是致病根本原因，在外界因素的影响下，如饮酒，劳累，长期服用有肝毒性的药物等，可促进病情的发展。丙肝的病理改变与乙肝极为相似，以肝细胞坏死和淋巴细胞浸润为主。慢性肝炎可出现汇管区纤维组织增生，严重者可以形成假小叶即成为肝硬化。HCV感染的发病机制主要包括免疫介导和HCV直接损伤两种，病毒因素包括病毒的基因型、复制能力、病毒多肽的免疫原性等；宿主因素包括人体的先天性免疫反应、体液免疫和细胞免疫反应等。饮酒、免疫抑制剂的使用等因素对HCV的感染病程也有影响。HCV病情发展丙肝患者症状1.丙肝患者很大一部分没有任何症状，慢性丙肝患者甚至可以在20年间没有任何明显症状。2.肝潜伏期一般为1.5-2个月，经过一段时间的潜伏期后，便出现肝炎的常见症状，有疲乏、身体无力、食欲减退、部分可出现黄疸等症状。3.丙肝患者右上腹部感觉不舒服、恶心、呕吐、食欲减退。4.少数丙肝患者伴低热，轻度肝肿大，有些患者可出现黄疸。5.少数丙肝患者体重减轻、肌肉关节疼痛，睡眠不好。6.患者肝功能指标多为正常或轻度异常。动物模型1.黑猩猩【病理反应最相似】2.树鼩HCV侵入HCV检测1.抗HCV[抗体]：多采用间接酶免疫法ELISA2.HCVcDNA/聚合酶链反应测定肝和血清中HCVRNA：选用高度保守的5′非编码区引物扩增放大后作电泳观察结果。本法较灵敏。由于肝和血清中HCVRNA出现较抗-HCV为早，一些HCV感染者抗HCV尚未阳转时，其肝和血清中已可测到HCVRNA。HCVRNA阳性，说明病毒在体内复制；HCVRNA阴转，说明病毒被清除。3.免疫组化法检测肝组织中HCV抗原：感染HCV的黑猩猩或病人血清中提取lgG，用间接免疫荧光或间接免疫酶组化法检测肝内HCV抗原。HCV-cAg、HCV-Ab、HCV-RNA三项联合检测已成为HCV感染的主要指标，可提高HCV感染“窗口期”的检出率。由于厂家之间使用HCV基因重组抗原质量及各抗原片段包被比例不同，各厂家试剂间的灵敏度和特异性存在一定差异，从而导致抗-HCV抗体检测结果不一致。由于HCV感染后到抗体的形成需要1～15个月，存在窗口期（平均70天），所以HCV-Ab阴性并不能排除携带HCV病毒并具有传染性的可能，而且尚有1%～3%的患者HCV-Ab可持续阴性，容易造成漏检。HCV-RNA定量检测灵敏度高，人在感染HCV后1～2周，血清中即可检测到，可反映病毒的复制情况与传染性，用于抗病毒治疗的选择和疗效监测，是诊断HCV的“金标准”。HCV-RNA检测具有早期、敏感和特异等优点，但HCV-RNA检测影响因素较多，RNA容易降解，易出现假阴性，抽血后必须尽快分离低温冷冻保存，所有器材必须高压灭菌，不适合临床样本常规筛查。HCV-cAg检测可将HCV检测的窗口期缩短至15天。HCV核心抗原存在时间仅有27~70d，延长难度大，因而HCV核心抗原测定仍不能脱离抗-HCV检测结果而单独进行。HCV核心区基因变异与HCV核心抗原检测结果有直接而复杂的联系，抗原检测敏感度并非一成不变。因而，对当前推广的试剂盒进行改良，就需要着重提升单克隆抗体的天然抗原构象表位亲和力。HCV核心抗原存在时间仅有27~70d，延长难度大，因而HCV核心抗原测定仍不能脱离抗-HCV检测结果而单独进行。HCV核心区基因变异与HCV核心抗原检测结果有直接而复杂的联系，抗原检测敏感度并非一成不变。因而，对当前推广的试剂盒进行改良，就需要着重提升单克隆抗体的天然抗原构象表位亲和力。相对成熟的成果是HCV核心抗原和外周蛋白抗体及部分核心抗体相结合的检测试剂盒。HCV核心抗原是HCV感染者体内出现的早期感染指标，几乎与HCV-RNA同时出现，这体现了核心抗原和HCV-RNA的动力学变化密切相关。HCV检验技术主要有HCV抗原检测技术、HCV-RNA核算扩增检测技术、抗-HCV检测以及HCV核心抗原和抗-HCV检测共4种类型。①HCV-RNA阴性，HCV-Ab、HCV-cAg阳性，表示丙肝病毒感染早期，而丙肝抗原没有被抗体完全结合，抗原抗体同时阳性，HCV-RNA＜1×103U/ml或RNA样本降解，有传染性；②HCVRNA、HCV-cAg阴性，HCV-Ab阳性，表示丙肝病毒感染后病毒已清除（自愈或治愈）；③3项指标均阳性，表示慢性丙肝病毒感染，有传染性；④HCV-RNA、HCVAb阴性，HCV-cAg阳性，表示早期丙肝病毒感染，HCVRNA＜1×103U/ml或RNA样本降解，有传染性；⑤HCV-RNA、HCV-Ab阳性，HCV-cAg阴性，表示丙肝病毒感染至少70天以后，慢性丙肝病毒感染，有传染性；⑥HCV-RNA阳性，HCV-Ab、HCV-cAg阴性，表示血液中HCV抗原滴度未达到试剂检测灵敏度，但HCV-RNA阳性表示有病毒感染，有传染性。传播途径1、输血及血制品曾是最主要的传播途径，常见的血液透析，输血等。国内曾单采血浆回输血细胞时污染，造成丙型肝炎暴发流行，输血后肝炎70%以上丙型肝炎，随着筛查方法的改善，此传播方式已得到明显控制，但抗HCV阴性的HCV携带供血员尚不能筛除，输血仍又传播丙型肝炎的可能，特别是反复输血及血制品者。2、非输血途径传播。【吸毒】此途径主要为反复注射、针刺、含HCV血液反复污染皮肤黏膜隐性伤口及性接触等其他密切接触方式而传播，这是散发性丙肝传播的途径。3、母婴传播。HCV阳性母亲传播给新生儿的危险率为2%，分娩时阳性则高达4%-7%；合并HIV感染；几率增至20%。4、性传播。精液和阴道分泌物中也可以检测到少量HCV,但实验证明，母婴的直系传播以及性传播的几率非常小。丙肝防治原则丙型肝炎的预防方法基本与乙型肝炎的相同。目前，我国预防丙型肝炎的重点应放在对献血员的管理，加强消毒隔离制度，防止医源性传播。国外报告，对献血员进行抗HCV筛查，可排除85%具有HCV传染性的献血员，从而明显降低输血后丙型肝炎的发病率。由于献血员抗HCV阳性率与ALT水平和抗-HBc是否阳性有关，ALT（丙氨酸转移酶）异常和抗HBc阳性者抗HCV阳性率明显高于ALT正常和抗HBc阴性者（44%：0.5%），因此，在目前尚无条件进行抗HCV筛查的地区，可对献血员作ALT和抗HBc筛查。据报道，排除ALT异常的献血员后，输血后丙型肝炎发病率可下降47.4%；排除抗HBc阳性的献血员后，输血后丙型肝炎发病率下降33%；如上述两项指标异常的献血员均被排除，则输血