LAMP原理培训PPT

1LAMP技术原理及应用北京蓝谱生物科技有限公司米佳E-mail:[e-mail]:010-82101210/11Mob:[phone]从样本中抽取、提纯DNA、RNA检测基因扩增检测基因扩增基因检测的流程扩增检测二步反应PCR扩增检测一步反应LAMP3LAMP法和PCR法的比较简单、快速、准确的基因扩增法LAMPPCR温度◎反应全程恒温△必须要有热循环时间◎约１５～６０分钟△２～３小时产物量◎约１０１０倍(100亿倍)△约１０７倍(1千万倍)特异性◎极高６区域４引物△２区域２引物检测◎无需其他检测步骤，根据扩增反应发生与否判断△需其他检测步骤试剂◎无需特殊试剂◎无需特殊试剂4LAMP法的引物设计5LAMP法使用的酶链置换型DNA聚合酶:BstDNAPolymerase①引物双链DNA聚②引物双链DNA解离的同时・・・聚③引物持续链伸长聚解离下来的单链DNA•扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链伸长。•LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。6解离链结合5’F1c5’TargetDNA(3)3’F3cB1F2cF1cB2B35’F1c5’3’F2B1cB2cB3cF15’F1cF23’(2)(1)F3cB1F2cF1cB2B35’3’F2B1cB2cB3cF13’F3cB1F2cF1cB25’3’B3F3cB1F2cF1cB25’3’3’F2B1cB2cB3cF1F3B3FIPF3Primer＋F3cB1F2cF1cB2B35’F3F1F2B1cB2cB3c5’3’(4)F1cF2B1cB2cB3c5’3’F13’结合结合解离连结合＋(5)(7)F1cB1cF2F1B2cB3c5’3’F1B1F2cF1cB2B33’5’(8)F1cF1F2cB15’3’B3PrimerB1cB2F25’F1B1cB2cB3c3’3’5’F1cB1cB25’BIP(6)F1cB1cF2F1B2cB3c5’3’F1F2cF1c3’5’B2B1c环状构造环状构造环状构造LAMP法的原理①哑铃状模板构造的形成过程7LAMP法的原理②扩增循环BIP(8)(9)(10)(11)F1F1F1cF1cF2F2cF1F1F1cF1cF2F2cF2cB1B1cB1B1B1B1cB1cB2cB2B1B1cB2cF1F1cB2cF1F1F1cF1cF2F2cB1B1B1cB1cB2cB2F1F1F1cF1cF2F2cB1B1cB1cB1B2cB2B2FIPF2cF2F1F1cF1cFIPB1B2cB1cF1cF1F1cF2F2cB1B1cB2B2B1cB2B1cF2F1F1cB1B1cB2cBIPB2B1cF28动画演示9环引物的应用①(8)(11)LoopPrimerBLoopPrimerFF1B1B1cB2F1cF1cF2cF23’5’B1cB2F1cB1F1F2B1cB2c3’5’10环引物的应用②PSA癌症转移标志基因CYP2C19公牛特异性序列HBVλDNA快速法（LoopPrimer：有）标准法（LoopPrimer：无）RNADNA11Mg2P2O7P2O74-+2Mg2+(Whiteprecipitate)DNAPolymerasePPi=P2O7dNTPsMg2+,DNADNA-(dNMP)n+nPPiLAMP法结果判断方式①----目视检查混浊12Mg2P2O7P2O74-+2Mg2+(Whiteprecipitate)DNAPolymerasePPi=P2O7dNTPsMg2+,DNADNA-(dNMP)n+nPPiLAMP法结果判断方式①----目视检查混浊13LAMPamplificationCalceindNTPsMn++UVquenchingCalceinPPi+Mn++Mn2P2O7UVfluorescence＋－Mg++Mg++LAMP法结果判断方式②----目视检查绿色荧光14误区：染料采用SYBRGreenI反应前加入：抑制LAMP反应反应后加入：违背了LAMP不开盖原则SYBRGreenI染料灵敏度高，20pg的DNA也能检测出，不能特异性地指示LAMP产物15Real-timeturbidimeterLA-320cTime(min)Turbidity-0.100.10.20.30.40.50.60.70102030405060Time(min)1061051041031021010copies/reactionTurbidityPurifiedHBVgenomicDNAwasusedasatemplate.实验室方法建立阶段----推荐采用标准法LAMP检测16推荐理由采用闭管扩增，可从源头上控制气溶胶污染实时检测，可根据各引物反应时间、效率筛选最佳引物及反应浓度LAMP反应时间的确定17误区：选择阴性对照不反应的引物-0.100.10.20.30.40.50.60.70.8020406080100120140TimeTurbidity10^710^610^510^410^310^210^1NC引物选择：①反应时间短；②扩增效率高；③阴性对照出峰时间是阳性最低检出限出峰时间的1.5倍以上。18LAMP方法建立阶段所需的试剂•模板DNA•引物FIPF3BIPB3•BstDNA聚合酶•dNTPs•反应缓冲液DNA扩增•模板RNA•引物FIPF3BIPB3•BstDNA聚合酶•逆转录酶•dNTPs•反应缓冲液RNA扩增19LAMP法实验室常规操作步骤DNA/RNA抽取、提纯扩增检测样本1.试剂调配2.样本DNA/RNA添加3.LAMP反应（扩增）4.检测目视检测（荧光）实时浊度检测样本中RNA/DNA的抽取约半小时约1.5小时以内20临床诊断试剂操作步骤干燥剂型产品，实现了试剂调配过程的简单化；并且使试剂的常温保存成为可能（区别于传统冷冻保存）。核酸提取简单化。例如流感检测试剂盒仅需把棉签在试剂中搅拌即可完成抽取步骤。不仅仅通过实时浊度，荧光・目视法也能进行结果判断。样品前处理的考虑：反应液的考虑：结果判定的考虑：21简易操作过程（以甲型流感为例）提取咽拭子放在抽取液中加入样本用干粉试管加入反应引物颠倒混合5次干粉状试剂（可常温保存）新型A型结果判断目测或浊度仪RT-LAMP反应35分钟提取样本检测完成1小时之内LAMP=快速、简便、高特异、低成本22流感试剂操作简介扩增试剂（反应试管），取出需要的管数（样本＋2）备用试剂准备引物溶液新型流感用(H1P)or甲型流感用(FluA)试剂分注10μL15μL核酸抽取加样LAMP反应离心后放入仪器62.5℃35分钟反应判定结果观察荧光通过浊度上升判断添加样品、对照将引物溶液分注到反应试管中倒置后静置2分钟，颠倒混合5次添加引物用采样棉签在抽取试剂重搅拌后，作为样品23小结：扩增反应在等温条件（60～65℃）下连续进行⇒可以使用简便、廉价的扩增装置扩增效率高、可在短时间内完成扩增⇒可在短时间内得出结果有非常高的特异性⇒可得出“扩增反应发生=有目的菌存在”的结论产生大量扩增产物，检测方法简便。⇒无需用电泳、特殊探针等，可通过浊度仪、荧光目视方法确认扩增结果从扩增到检测可在1个反应试管内（封闭系统）完成⇒可防止由于扩增产物产生的污染。从RNA经一步反应可完成扩增⇒无需另外进行逆转录反应24LAMP法的应用25临床领域农业领域畜牧业领域食品领域环境领域灵活运用能够简单、快速地进行基因扩增的特征，在各个领域得到广泛应用。・食物中毒致病菌的检测・食品的卫生管理・食物中毒的防止・病原菌・病毒的检测及鉴定・通过SNP多态性分型决定用药量工业领域・工业产品用大量DNA的生产成为可能・植物病害的早期发现及蔓延防止・转基因作物的检测・雌雄性别判断・病原微生物的检测・遗传病的发现・环境、水中病原微生物的检测例如・・・LAMP法的应用领域26LAMP法的应用例（科研）论文报告（科研・临床对象）•细菌・真菌・寄生虫•结核菌、耐酸菌•肺炎链球菌•支原体•流感嗜血杆菌•百日咳菌•绿脓杆菌（MDR）•MRSA•疟疾•肠毒毒素大肠杆菌•组织侵袭性大肠杆菌（EIEC）•伪膜性结肠炎•Enterococcusfaecalis•口腔细菌（齿周炎病菌）•绿脓杆菌•H.pylori•真菌•病毒HSVCMVVZVEBVHHV-6HHV-7HHV-8腮腺炎病毒麻疹病毒RSV日本脑炎病毒细小病毒B19风疹病毒登革热病毒埃博拉病毒腺病毒流感病毒HPVHAV•感染症以外应用胃癌微转移术中快速诊断（PubMed检索keyword「LAMPisothermalamplification」）进行引物设计，确立LAMP法检测体系→学会报告、论文发表II.LAMP法について27LAMP法试剂盒产品★细菌・原生动物环境卫生检查用Loopamp军团菌检测试剂盒E（公定法収載）Loopampクリプトスポリジウム检测试剂盒Loopampジアルジア检测试剂盒食品・环境检测用Loopamp沙门氏菌检测试剂盒Loopamp肠道出血性大肠杆菌检测试剂盒（公定法収載）Loopampベロ毒素(VT)タイピング试剂盒Loopamp大肠杆菌O157检测试剂盒LoopampL.monocytogenes检测试剂盒Loopampカンピロバクター检测试剂盒Loopamp引物组A.acidoterrestrisLoopamp引物组冷水病菌（指針収載）★病毒LoopampH5亜型インフルエンザウイルス检测试剂盒（体外診断用医薬品）LoopampSARS冠状病毒检测试剂盒（体外診断用医薬品）Loopamp诺如病毒GI检测试剂盒Loopamp诺路病毒GII检测试剂盒Loopamp引物组WNVLoopamp引物组AvianFluH5Loopamp引物组AvianFluH7Loopamp引物组KHV（指針収載）H1pdm2009引物组（干燥剂形用）FluA引物组（干燥剂形用）★SNPｓ（单碱基多型）LoopampP450タイピング试剂盒(CYP2C19＊2)LoopampP450タイピング试剂盒(CYP2C19＊3)LoopampP450タイピング试剂盒(CYP2C9＊3)★其他Loopamp牛胚胎性别判断试剂盒Loopamp诺如病毒GⅡ检测试剂盒LoopampH5亚型禽流感检测试剂盒28应用LAMP法的诊断试剂•Loopamp®SARS冠状病毒检测试剂盒2003年12月、作为体外诊断用医药品开始销售2010年6月2日、生产销售许可取得•Loopamp®支原体P检测试剂盒2010年5月24日、生产销售许可取得•Loopamp®H1pdm2009流感病毒检测试剂盒•Loopamp®H5亚型禽流感病毒检测试剂盒2008年11月、作为体外诊断用医药品开始销售•Loopamp®军团菌检测试剂盒C2010年5月24日、生产销售许可取得生产、销售许可申请中•甲型流感病毒检测试剂盒生产、销售许可申请中•结核病菌检测试剂盒29作为指定方法的LAMP检测法2006年12月最终修订、农林水产省「特定疾病对策方针」登载•Loopamp®KHV引物组2008年3月修改、鲇鱼冷水病对策协议会「关于鲇鱼冷水病防疫的指南」登载•Loopamp®冷水病菌引物组•Loopamp®军团菌检测试剂盒E2009年3月、「军团病防治指南第3版」登载30一点建议：•实验室严格PCR分区–溶液配制区、样品处理区、检测区•基本操作–混匀、吸取–模板最后加入，按照先阴性、后阳性，从低到高梯度。•环境污染–UV照射（500bp）–DNAZAP等DNA降解试剂31谢谢！