pcr的温度设置

温度与时间的设置设置变性-退火-延伸三个温度点设置变性-退火-延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸①变性温度与时间变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性若低于93℃则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败②退火(复性)温度与时间退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想②退火(复性)温度与时间退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）复性温度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合③延伸温度与时间TaqDNA聚合酶的生物学活性：70～80℃150核苷酸/S/酶分子70℃60核苷酸/S/酶分子55℃24核苷酸/S/酶分子高于90℃时，DNA合成几乎不能进行③延伸温度与时间：延伸温度：一般选择在70～75℃之间常用温度为72℃过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）3～4kb的靶序列需3～4min扩增10Kb需延伸至15min延伸进间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些