PCR及其改进技术在食品检测中的应用

PCR及其改进技术在食品检测中的应用ApplicationofPCRandPCRimprovedtechnologyfordetectioninfoods刘辉1，杨利平1，2，张滨1*LiuHui1,YangLiping1,2,ZhangBin1*（1．长沙环境保护职业技术学院，长沙410004；2．湖南师范大学生命科学学院，长沙410081）(1.ChangshaEnvironmentalProtectionandProfessionaltechniqueCollege,Changsha410004,China;2.Departmentoflifescience,Hunannormaluniversity.Changsha410081,China)摘要：在介绍传统PCR的基础上，简介实时定量PCR、多重PCR、PCR-DGGE等几种常用的PCR改进技术在食品检测方面的应用。关键词：PCR改进技术；传统PCR；食品检测Abstract:Themethodswererapidlyupgradedfordetectioninfoodswhenthefactorsoffood-pollutionbecamemoreandmorecomplicated.PCRimprovedtechnologygraduallyreplacetheroleoftraditionalPCRfordetectioninfoods.Inthispaper,weintroducedtheapplicationofthreePCRimprovedtechnologiesfordetectioninfoodsonthebaseofintroducingtraditionalPCR.ThethreePCRimprovedtechnologiesincludereal-timePCR,MULTIPLEX-PCRandPCR-DGGE.Keywords:TraditionalPCR;PCRimprovedtechnology;Detectionin近年来,随着我国社会经济的快速发展，人们的生活得到很大改善，对食品质量的要求也越来越高。加入WTO以后，国外对我国出口食品的质量要求也越来越严格。食品安全是一个重大的世界性公共卫生问题，随着食品生产的工业化和新技术、原材料、新产品的采用，食品污染的因素日趋复杂，因此食品安全检测的方法也需日新月异。自从1985年问世以来，PCR（PolymeraseChainReaction）技术因其灵敏、快速、操作简便的优点，在食品检测领域具有广泛的应用。但是传统PCR检测技术一直面临着假阳性污染和定量准确度两大难题，用传统的PCR检测技术都依赖于各种不同类型的PCR后处理过程，而这些处理过程很容易使数量巨大的PCR产物飞散到空气中形成气溶胶，使PCR假阳性污染成为可能，而且电泳所用染色剂EB（溴化乙锭）为强烈致癌物质，容易危害操作者的健康。近年来，PCR改进技术在食品检测中的应用研究得越来越多，本文将简介几种PCR改进技术在食品检测中得应用研究进展。1传统PCR技术在食品检测中的应用及其缺点PCR（PolymeraseChainReaction）技术即聚合酶链式反应技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。该技术自从1985年问世以来，最早应用于基因克隆和转基因检测，但由于其精确、微量的特点，已经广泛应用到其他领域。随着对一些主要食品微生物遗传性质了解的逐渐深入，许多致病菌的遗传背景进一步明了，PCR技术在食品检测中也逐渐显示出其应用前景[1]。近年来，PCR技术在食品检测中的应用主要体现在如下几个方面：基金项目：长沙环境保护职业技术学院生物化学精品课程建设项目资助（项目编号：？）作者简介：刘辉(1976-),女,长沙环境保护职业技术学院讲师。Email:?*通讯作者，张滨1.1食源性致病菌的检测利用PCR方法对病原菌进行检测早在1992年就有报道[2]，然而利用PCR技术从食品中检测病原微生物到近几年才比较广泛应用。Uyttendaele等用PCR方法成功检测出牛肉产品中的大肠杆菌污染。经过几年的发展，利用传统PCR技术能够检测出的病原菌主要有单增李氏菌、肠出血性大肠杆菌0157、H7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、性小肠耶尔森氏菌[3,4]。1.2食品中成分种类的检测为了防范某种特定动物病，比如疯牛病，需要鉴定食物中动物成分种类，PCR技术因其简便、灵敏、快速的优点而被广泛应用。2004年，李林等应用PCR方法鉴别肉骨粉中的动物成份种类[5]。1.3食品中有效成分的检测当今对食品质量的要求不仅仅局限于货真价实，色、香、味俱全，而且还在于各种营养成分的数字指标。尤其是加工食品，由于经过几道加工工序，大多数原料已经完全变形，无法以传统手段(如感官)辨别出其原料品质的优劣与相关成分，消费者也只能从厂家的说明书中获取信息，这样必然给一些不法厂家提供了以次充好、甚至使用低值代用品的机会。PCR技术在加工食品，尤其是深加工食品的有效成分鉴定方面具有重要作用。2006年陈文炳等应用建立了一套系统鉴定了豆奶粉、奶粉及果汁饮料中的有效成分[6]。1.4转基因食品的鉴定PCR检测技术是目前转基因存在的检测方法中最为成熟的，即可做定性又可做定量分析。转基因食品重组DNA的基本结构包括启动子、目的基因、终止子和标记基因，到目前为止全世界已有30多种源基因食品得到相关国家的安全评价，在现有的商品化源基因食品中绝大多数含转录启动子CaMV35s、转录终止子NOS及抗生素抗性基因NIPTⅡ。这就为人们建立相应的PCR筛选检测方法提供了便利[7]。迄今为止,利用定性PCR检测技术可检测如大豆、玉米、番茄、油菜等多种转基因作物[8]。传统的PCR技术在实际应用中也表现出一些缺陷,例如在有死细菌存在的情况下容易产生假阳性、不能检测致毒微生物产生的毒素等[1]。传统的PCR技术的检测结果也有可能与实际不相符合，会出现假阴性或假阳性结果。例如，在转基因食品的鉴定中，检测物质本身含有转基因特制而未被检出，或者本身没有转基因物质而检出有转基因成分[7]。2PCR改进技术在食品检测中的应用PCR的改进技术就是随着生物技术的飞速发展和各项新技术与PCR技术的有机结合,针对如何控制外源DNA的污染、如何控制突变和如何利用PCR技术鉴别致毒微生物产生的毒素等，反展起来的一系列新技术，在食品检测中的应用越来越广泛。本文主要介绍实时定量PCR技术、多重PCR技术、PCR-DGGE技术等三种改进技术在食品检测中的应用。2.1实时定量PCR技术及其在食品检测中的应用实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。实时定量PCR技术采用完全闭管检测，采用实时检测技术和稳定无干扰的荧光激发光源，不需PCR后处理，避免了交叉污染；从检测开始到定量结束，整个过程耗时短，操作方便，能非常精确、特异的进行检测。近年来，实时定量PCR技术在食品检测中的应用研究越来越广泛。在食物加工过程中外源DNA污染的定量，病原微生物的检测、掺假量的检测、转基因食品的检测方面都具有重要的应用。MμLeG等人[9]利用实时定量PCR检测葡萄中曲霉菌的污染程度。为了防止食品中掺假，西班牙,意大利和法国规定普通小麦在面条和粗粒小麦粉中的含量,SandbergM等人[10]利用实时定量PCR技术检测谷物基因来控制那些缺乏麦麸的婴儿食物。Alery等[11]证实利用实时定量PCR技术是估计这些食品中普通小麦量的理想技术，曹际娟等[12]运用实时定量PCR技术检测了肉骨粉中牛羊源成分、定量的测定了转基因玉米MON810成分和对转基因玉米GA21品系进行了鉴定。潘良文等[13]运用实时定量PCR对转基因抗草甘磷油菜内源特异参照基因BnACCg8和外源E9’3终止子以及对转基因抗草丁膦油菜籽中Barnase基因进行测定。2.2多重PCR技术及其在食品检测中的应用多重PCR技术就是指在单一PCR技术的基础上进行改进的一种技术，是将多条引物和多条模板混合在一个反应体系中分别特异扩增不同的目的条带，或者多条引物和单一的模板DNA混合在同一反应体系中扩增同一模板的不同片断，常用于对超长片断的扩增。和传统单一的PCR技术相比，多重PCR技术具有高效性、系统性和经济简便的特点。自从1988年由Chambercian等首次提出并应用这一方法以来，多重PCR技术在生物医药方面具有广泛的应用，近来，在食品检测中的应用也具有重要的应用。焦豫良等应用多重PCR技术一次性可以检测出出肠毒性大肠埃希菌(E.coli2ETEC)，蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)，沙门菌属(Salmonellaspp)，大肠埃希菌O157:H7(E.coli2O157:H7)，志贺菌属(Shigellaspp)，霍乱弧菌(Vibriocholerae)等菌属或菌[14]。冯家望等利用多重PCR技术的快速可靠、灵敏准确、操作简便、成本低廉等特点，建立了一种快速检测市售的大豆、玉米、油菜及其加工产品中的转基因成分的方法[15]。2.3PCR-DGGE技术及其在食品检测中的应用PCR-DGGE技术是由Sheffield等1989年首次提出，将变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术和PCR技术结合起来，可分离长度相同但是碱基不同的DNA片段混合物的一项技术。PCR-DGGE技术将PCR和DGGE结合起来在变性条件适当的情况下能分辨一个碱基对,具有特异性强、敏感性高的特点。染色后的凝胶用成像系统分析可以在一定程度上反映样品的复杂性。条带的多少能反映样品中微生物组成的差异，条带的亮度能反映样品中微生物的多少。由于PCR-DGGE具有以上优点，在食品检测中，尤其是食品微生物的检测中具有重要的作用。采用PCR-DGGE技术进行食品微生物检测时，首先要提取食品样品中的RNA或者DNA，利用保守的基因片段如细菌中的16SrRNA，真菌中的18SrRNA或26SrDNA等基因片段作为模板，在一对特异性引物的作用下对样品中微生物中的rDNA或rRNA进行PCR或者逆转录PCR扩增，核酸扩增后电泳获得的指纹图谱包含了与多种微生物相对应的一系列条带，可以将这些条带进一步纯化和进行序列分析鉴定出微生物的种类[16]。1999年，Ampe等[17]应用PCR-DGGE技术直接从面团中中鉴定乳杆菌和木薯淀粉发酵中的微生物菌落。Ercolini等[18]用PCR-DGGE方法直接鉴定天然的乳清培养基中对Mozza-rella奶酪生产起作用的微生物，鉴定出德氏乳杆菌、乳球菌和嗜热链球菌等嗜温的乳酸菌和一些污染物。3PCR改进技术存在的问题与优化上面提到的几种PCR改进技术与传统的PCR技术相比较具有许多优点，在食品检测中的应用越来越广泛。但是PCR的几种改进技术也存在着一定的缺陷。随着生物科技的发展和食品检测的需要，PCR改进技术会越来越多，现在发明的几种改进技术也会得到进一步优化。实时荧光定量PCR技术在检测的过程中会受到包括：同源和异源DNA背景、寡核苷酸杂交特异性、Taqman探针比例、细胞裂解效率、mRNA的部分降解、PCR产物长度的长短等因素影响，可造成定量结果出现偏差或导致假阳性结果，因此在操作时必须对所设计引物的特异性进行充分验证和条件的最优化研究。现在使用的引物探针大多数来自Taqman公司，其合成成本较高，需要专门的实时定量PCR仪器，成本比较高。因此降低探针制备的成本或发掘新的荧光染料、进一步提高分析的灵敏度及实验重复性、样品制备简单化、程序化和机械化以提高效率及降低成本将成为今后的发展趋势。多重PCR技术在食品检测中存在引物之间的抑制、引物和其它模板间的非特异性结合等缺点。因此，在使用多重PCR技术检测食品时，要考虑引物与引物间、引物与模板间的作用因素，优化引物设计和PCR反应的条件，避免假阳性和假阴性的结果出现。食品成分的复杂性及采样和样品处理可能会使DNA提取产生误差，会使