QPCR原理

兼顾速度与可靠性EppendorfPCR系统20YearsofPCRKaryMullisPCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。…它最大的特点就是能不断推出新形式。——摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow]TTTTTAAACCCCCAAAATTTCCCCCCTAAGGGGGGGGGGGDenaturation94°CAnnealing55°CElongation72°CPolPolPCR5‘3‘5‘3‘SeparationofstrandsAnnealingofprimerElongationbypolymerasePCR后分析结果PCRproductsindifferentsizes3kb500bp300bp为什么终点法定量不准确?CtEndpoints同一样品尽管平台期DNA拷贝数波动很大，CT值却是相对固定的。典型的PCR四阶段半对数图谱线性图谱平台期典型的PCR四阶段线性增长期基线期指数增长期PCR理论方程lg[DNA]循环数线性期平台期y=x(1+e)n指数期N=N0x(1+e)nN:产物分子数N0:起始分子数e：扩增效率n:循环次数PCR理论方程只在指数期成立PCR指数增长期的规律PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：Yn=X·(1+E)n0≤E≤1其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，X为n-1个周期后PCR产物的分子数量。等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增.定量PCR测定的测定点为PCR扩增的指数扩增期;而定性PCR测定的测定点则多为PCR扩增的平台期为什么终点法定量不准确?CtEndpoints同一样品尽管平台期DNA拷贝数波动很大，CT值却是相对固定的。Ct(ThresholdCycle)-Thecyclenumberwherethereactionfluorescenceexceedsbackgroundfluorescence.Cycle#FluorescenceCtCtCtThresholdThreshold-Thepeakofbackgroundfluorescence,asdefinedbytheplatformortheuser.BackgroundFluorescenceAmplificationPlot定量分析原理Yct=X·(1+E)n=2nXEct=1CT值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。CT值与起始模板浓度成负相关关系,不同CT值的模板起始浓度相差2n倍,n为CT间差值为什么CT值起始DNA浓度?当循环次数n=CT值时：RCT=RB+X0(1+e)CTRslg(RCT-RB)=lgX0+CTlg(1+e)+lgRsCTlg(1+e)=-lgX0+lg(RCT-RB)–lgRs)1log(log)log()1log(logXSBTXOTERRREXC即CT=-klgX0+b（线性方程）Rn=RB+X0(1+e)nRs定量PCR的实质模板定量找到PCR的指数增长期定量数据归一化real-timePCR应用范围科研的主要工具•mRNA与基因表达的研究•DNA拷贝数的检测•单核苷酸多态性（SNPs）的测定•DNA芯片结果认证医学方面应用前景更是令人鼓舞•极微量的基因表达定量•病原体检测绝对定量Unknown通常用标准品作为外参照制作标准曲线.注意保持与目的基因的同源性标准曲线的制作什么是阈值基线阈值标准偏差基线信号的标准偏差x10CT值基线阈值基线阈值CT值••••••••••••I3,125I6,250I12,500I25,000I50,000I100,000Absoluteamount.(copies)EXACTscale20-19-18-17-16-15-CTABCCT161819Absoluteamount50,000copies12,500copies6,250copiesSampleASampleBSampleC标准曲线方法通过CT值测定起始DNA量•浓度增加1倍，CT值减小1个单位•浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位相对定量∆CtSample∆CtNontreatedsampleHousekeepingGene∆Ct∆Ct∆∆Ct2-∆∆Ct=ChangeinExpressionLevelGeneofInterest相对定量DCt=9.70DCt=-1.7DCt=target-refDCt=target-refDifference=DCt-DCt=DDCt=9.70-(-1.7)=11.40IL1-bconRPLP0conav=19.93av=29.63controlIL1-bvitRPLP0vitav=19.80av=18.03experiment-2-DDCt=-2[(Ctarget-Ccalibrator)]-[(Ctarget-Ccalibrator)]DNA芯片结果复证DNA甲基化检测BeforeBisulfiteTreatment:Wild-TypeDNA5’...GCGGACCGCG..AfterBisulfiteTreatment:UnmethylatedDNA5’...GUGGAUUGUG..MethylatedDNA5’...GCGGAUCGCG..高通量SNP筛查Amplifluor™Primer(UniPrimer™)QuencherPCRSNPRealTimePCR技术的诞生•1992年，HiguchiR等第一个报导了实时定量PCR技术HiguchiR,FocklerC,etal.KineticPCRanalysis:real-timemonitoringofDNAamplificationreactions.Biotechnology,1993,11(9):1026-1030.所谓实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号累积实时监控整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.实时定量PCR技术是PCR技术和荧光检测技术的结合FluorescentDyes荧光分子或荧光染料ExitationpeakEmissionpeakReactionAmplificationPlotTime(Cycle#)Fluorescence荧光信号累积与扩增曲线荧光分子或染料的检测方法荧光分子内参式检测（DNASpecificDyes）•SYBRGreenI荧光标记的特异探针•水解探针:Taqman•杂交探针:FRET（DualProbes）•分子信标:MolecularBeacons•荧光标记引物:Scorpion和Amplifuor•其它类:BDQZymeDNAspecificDyese.g.SYBRGreenIExcitation494nmSYBRGreenI的检测原理Emission521nm熔解曲线分析引物二聚体Temperature[°C]949290888684828078767472706866646260-dI/dT(%)1009080706050403020100-10-20-30-40-50-60PrimerdimersProductofInterestUNG预防污染52°C2:00UNGtreatment95°C10:00enzymeactivation60°C1:00annealing/extension95°C0:15denat.UNG酶的作用原理是降解含有dU的双链或单链DNA。它在50°C激活，95°C灭活.用于预防非特异性PCR扩增和污染。在定量PCR开始前增加50°C的保温步骤，UNG酶即可将已有的PCR产物降解破坏，防止可能造成的污染仪器热启动•Innovativetechnicalfeaturefordevice-supportedHotStartPCR•Perfectcombination:MastercyclerepSandHotMaster•EnhancesthePCRtonearlythemaximum脉冲PCR=超快的升温速度+极大缩短初始升温所需时间Blocktemperature[°C]Time100806040206°C/sec8°C/secTaqMan探针法的核心:利用Taq酶的5→3′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号FRET荧光共振能量转移FluorescenceResonanceEnergyTransferTaqMan探针原理TAGCCTGCAGAGRQReporterQuencherReal-TimeQPCR常用染料Alx350FAMTETHEXJOEROXCy5Cy3TAMTxRdTTTTTAAACCCCCAGGGGGGTTTTTAAACCCCCAGGGGGGTTTAACCCCGGGTAGCCTGCAGAGRQTaqMan探针原理当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号TTTTTTTGGGCCCCAAAAGCCGATR多探针的反应体系TwoormoreProbesandDyesinoneTubeTAGCCTGCAGAGR1QTAGCCTGCAGAGR2QTarget1Target2微卫星系统Mastercyclerep-新一代PCR仪的代表超快的升/降温速度脉冲PCR独立直观的控制面板ESP电子样品保护热盖Mastercyclerep系列-多种模块选择铝块铝块银块Eppendorf在定量PCR领域厚积薄发Mastercyclereprealplex实时定量PCR仪的开发秉承了Eppendorf既往的经验.是将经验融入最新技术的精品之作回顾Eppendorf60年的发展历史，当之无愧为高品质实验室仪器的供应商。Eppendorf拥有55年生产光学仪器的经验，近10年来，热循环仪已成为Eppendorf产品家族中的重要组成。。real-timePCR仪器构造ExitationlightsourceFilterDetector热循环仪光学元件软件分析MastercyclereprealplexA4-colourdetectionunitinaspacesavingdesignThermalModuleSlidingOpticsModuleMastercyclerep升级为定量PCR仪epGradient/S两通道epRealPlex2四通道epRealPlex4六通道epRealPlex6COMINGSOON!在Mastercyclerep梯度PCR的基础上，整合一个可靠而高度灵敏的光学检测系统，就构成了最新的Mastercyclereprealplex实时荧光定量PCR系统。Mastercyclereprealplex-模块化设计A.Mastercyclereprealplex2•96LEDArrayexcitationat470nm•1channelphotomultiplier(CPM)•2detectionwavelenghts:520nmand550nmB.Mastercyclereprealplex4•96LEDArrayexcitationat470nm•2channelphotomultipliers(CPM)•4detectionwavelengths:520nm,550nm,580nm,605nmTwoThermomodules•Aluminumblock(epgradient):4°C/sheating,3°C/scooling•Silverblock(epgradientS):6