血液代用品

生物产品工艺品第八章血液代用品第八章血液代用品8.1概述8.2全氟碳人工血液8.3血红蛋白类血液代用品8.4血液代用品的发展前景8.1概述血液的结构由细胞成分和非细胞成分组成。细胞成分：红细胞、白细胞和血小板非细胞成分：称为血浆，其中又包括胶体成分和晶体成分。血液血细胞红细胞白细胞血小板血浆(细胞间质)水血浆蛋白、糖、维生素、激素、代谢产物及无机盐等常规输血的忧患输血时必须血型相配，延误治疗而造成死亡；血液污染严重，威胁输血安全；健康供血人群不足，血液严重短缺；血液的保存期短。8.1概述——血液代用品定义指具有携带氧扩容功能的溶液，即除了可用于失血补充和出血休克的复苏外，在临床上还可用于血液稀释等。8.1概述——人工血液代用品特点（1）安全，应无毒、无致病原、无污染、无免疫原性；（2）适合各种血型；（3）与人血液所有组分具有良好生物相容性，最大限度的替代人血的生理功能,（具备运输氧、二氧化碳的能力，提供缓冲和自由基淬灭能力，可起到血浆扩容作用并维持胶体渗透压)；（4）在血管内有满意的保留时间，代谢产物无毒并能经正常渠道排出；（5）贮存时间长而所需条件低。8.2血红蛋白的结构和功能血红蛋白的结构和功能；影响血红蛋白氧亲和力的因素。Hb的组成与结构Hb4条珠蛋白链：α141×2；β146×2（共574个AA）4分子血红素每条多肽链结合一个血红素分子构成一个Hb单位∴Hb是四聚体，在红细胞中占干重的95％Hb的组成8.2血红蛋白结构蛋白质部分为珠蛋白（globin）、辅基为亚铁血红素(heme)珠蛋白是由4条肽链组成，包括α和β亚基，形成α2β2四聚体；血红素辅基位于表面孔穴内，每个亚基一个；在4个亚基间有一中央孔穴:2,3-二磷酸甘油酸（2,3-DPG)位于其中，稳定了脱氧血红蛋白的结构,O2位于其中，稳定了氧合血红蛋白的结构。血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：血红蛋白功能血红蛋白在红细胞内能结合氧或释放氧；在肺部与氧结合形成氧和血红蛋白（HbO2），转运到全身各组织并释放出氧。将产生的二氧化碳以碳酸盐的形式从组织中运出，从而完成肺和组织间O2和CO2的交换。血红蛋白——对氧的亲和力氧解离曲线图8-2氧解离曲线P50血红蛋白——对氧的亲和力机制——Hb的变构效应波尔效应2，3-DPG的影响影响血氧亲和力的因素H+和CO2浓度增加促进氧分子的释放(快速)Hb(H+)+4O2Hb（O2）4+H+Hb(CO2)n+4O2Hb（O2）4+nCO22，3-DPG作为别构效应物降低脱氧血红蛋白对氧的亲和力。（代谢生成，反应较慢）Hb-2,3-DPG+4O2Hb（O2）4+2,3-DPG都是通过改变血红蛋白的结构调节血氧亲和力。血红蛋白氧解离曲线CO2pHDPG温度CO2pHDPG温度8.3血液代用品的类型无载氧功能的血管扩容剂（第一代红细胞代用）；全氟碳化合物、化学修饰血红蛋白及基因重组血红蛋白（第二代血红蛋白代用品）；模拟天然红细胞膜和红细胞内的生理环境，用仿生高分子材料将血红蛋白包裹起来，制备成“人工红细胞”。（第三代血液代用品）8.3.1全氟碳人工血液概念是一种具有载氧功能的人造血，是将碳氢化合物中的氢原子全部由氟原子代替，形成的类环状或直链状有机化合物。种类全氟萘烷、全氟三丙胺、全氟三丁胺应用用于急性贫血血液极端稀释时，以维持机体组织的供氧，为输血争取时间。全氟碳化合物全氟萘烷全氟碳人工血液优点无抗原性、无毒性；不依赖于过期或其它动物的血液，易于大量生产；纯度易于控制。缺点（1）只是氧的溶解剂，使用时患者必须呼吸足够的氧气才可保证氧气溶解量；（2）循环时间短，高浓度使用可使血液粘度升高；（3）存放需要合适的温度和条件；（4）流感样症状。8.3.2血红蛋白类血液代用品天然血红蛋白；血红蛋白类血液代用品；1）血红蛋白的制备；2）血红蛋白的化学修饰。天然血红蛋白（SFHS）定义是一种直接用红细胞溶解产物来作为血液代用品，用过期的血液来制造，去除了基质磷脂，是一种非细胞携氧物质。又称为无基质血红蛋白。天然血红蛋白（SFHS）优点来源广泛、符合人体生理需要；无需进行交叉验血、能去除病原、能长期储存。比全氟碳化合物更符合人体生理需要，来源广泛；8.3.2血红蛋白类血液代用品血红蛋白的制备样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定1.样品处理：蛋白质提取和分离步骤操作过程可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白(1)红细胞的洗涤:①洗涤目的:去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。②洗涤操作：1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。初次离心后的结果次洗涤后的结果(2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。(4)透析：①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。②原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。透析过程动画演示利用透析袋透析装配好的凝胶柱凝胶分离纯化注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。收集得到的纯化后的蛋白无基质血红蛋白（SFH)1）因SFH在血浆中很快从四聚体分解为二聚体或单体，易于通过肾脏，故其半衰期过短，仅2h-4h左右；2)SHF失去了2，3-DPG类物质的变构作用，其氧亲和力明显升高(氧离曲线P50下降)，故不利于向组织细胞释放氧；3)因SFH可滤过至肾小管管腔，而高浓度的蛋白类物质可引起管腔堵塞，导致肾功能受损；4)SFH具有胶体性质，在血浆中可产生胶体渗透压(COP)，在其血浆浓度与全血相同时，COP可达全血的2倍，故在常规应用时，其浓度最高只能在7g％；(5)Hb易氧化成高铁Hb(MetHb)，失去携氧能力并产生自由基。血红蛋白类血液代用品血红蛋白的化学修饰目的：稳定血红蛋白4聚体结构，增加蛋白相对分子量，以达到降低毒性的作用。原理：表面有许多可修饰的功能基团类型：分子内交联血红蛋白、多聚血红蛋白、共轭血红蛋白、脂质体包封血红蛋白；基因重组血红蛋白图8-3血红蛋白的修饰方法8.3.3化学修饰血红蛋白（第二代血液代用品）方法交联血红蛋白聚合血红蛋白共轭连接血红蛋白分子内交联血红蛋白血红蛋白的化学修饰血红蛋白肽链间的交联，降低氧的亲和力。试剂：含有负电基团并能结合在血红蛋白中心腔位置，如双阿司匹林类化合物（3，5-二溴水杨基双延胡索酸酯），吡哆醛类化合物。产品：美国Baxter公司的DCLHb、加拿大Hemosol公司的Hemolink分子内交联磷酸吡哆醛(PLP)是2，3-DPG的结构类似物，可使Hbβ亚基的氨基端Val吡哆醛化；与Hbβ亚基的2,3-DPG结合位点形成共价键可以降低氧亲和力；但由此形成的四聚体不稳定。为了克服PLP的缺点。人们后来合成了含有2个吡哆醛的双醛基衍生物，降低天然Hb的氧亲合力并阻止其解聚。双阿司匹林交联（DCL-Hb)3，5-二溴水杨酸在与琥珀酸或延胡索酸连接后形成双阿司匹林(DBBF)，成为血红蛋白赖氨酸的氨基共价交联的碳桥。DBBF对脱氧血红蛋白修饰效果较好，为α-α交联，可产生一种稳定的、高协同性和低氧亲和力的双阿司匹林交联Hb(DCL-Hb)，其功能特征与人血液很相似，DCLHb血红蛋白的化学修饰不少于97％的聚合体的分子量为65kD一130kD，低于5％的聚合体分子量小于65kD。临床：患者出现皮肤黄染、无症状血尿、肠梗阻发生率显著提高，三期临床死亡率增加，于1999年终止临床试验。Hemolink血红蛋白的化学修饰O-棉籽糖交联血红蛋白，由各种相对分子量的聚合、非聚合成分组成，含交联Hb大于95%。临床：三期已在美国、英国和加拿大开展。不良反应是血压升高，但在48-72小时内恢复对肝肾功能无影响。多聚血红蛋白血红蛋白的化学修饰在分子内交联的基础上采用交联剂使血红蛋白分子之间聚合形成较大的分子；交联剂主要有戊二醛、乙醇醛、糖醛等。与血红蛋白反应时无特异的结合位点，属于多位点修饰，形成形成2~6个四聚体的聚合物。减少溶液中分子数目，溶液渗透压和黏度也随之降低，半衰期延长。多聚血红蛋白采用戊二醛多聚化牛Hb,产品：美国Biopure公司的Hemopure,被许可用于临床。市场定价：800美元/200ml。NorthfieldLaboratories公司生产的Polyheme；戊二醛聚合人血红蛋白，在制备过程中去除了大部分未聚合血红蛋白，消除了大部分不良反应；缺点：原材料匮乏。共轭连接血红蛋白将Hb四聚体与生物兼容性良好、能在血液循环系统中长时间停留的大分子相互连接;加大Hb的分子量，稳定四聚体的结构。采用的共轭物有聚氧乙烯（POE）、单甲氧聚氧乙烯(MPOE)、葡聚糖多聚糖类似物、聚乙二醇(PEG)等。大分子聚合物包裹在Hb周围的高分子链覆盖了抗原位点，起到了降低免疫原性。化学修饰存在的问题血红蛋白的化学修饰产品是非均一性混合物；病原微生物尚未解决；大分子的聚合体引起轻微肾毒性，引起血小板减少和白细胞减少症等副作用；终产物不稳定性，导致交联Hb间的重新排列；重现率低，多聚体的多聚化会增加氧亲和力并降低四聚体间协同作用。8.3.4脂质体包封血红蛋白（第三代红细胞代用品）思路：仿造天然红细胞，制作“人工红细胞”将高浓度的Hb包在脂质体内,包裹于膜内的Hb的四聚体不易解聚，因而载氧能力大，循环半衰期长，副作用小。采用磷脂制成双分子层膜，加入胆固醇增加膜的韧性和稳定性，加入2，3-DPG降低Hb的氧亲和力，加入VE防止Hb的氧化。脂质体包封血红蛋白血红蛋白的化学修饰制备的两个基本条件：1）制备过程中确保极易被氧化的血红蛋白不被氧化；2）脂质体包封血红蛋白及其辅助成分在制备和保存过程中有足够的稳定性，并使脂质体包封血红蛋白的循环存留时间延长。工艺发展脂质体包封血红蛋白工艺的发展血红蛋白的化学修饰第一代脂质体：从鸡蛋、大豆中提取的不饱和脂肪酸、胆固醇以及维生素E等造成：1）半衰期短；2）不饱和脂质在血浆中的氧化使血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白。第二代脂质体：长链饱和磷脂（氢化大豆卵磷脂），延长半衰期，降低了脂质过氧化，但存在溶血磷脂等杂质。后来改为使用高纯度的合成二硬脂酰卵磷脂，但磷脂双层与血红蛋白相互作用，引起血小板活化因子浓度升高。脂质体包封血红蛋血红蛋白的化学修饰第三代：第二代脂质体包封血红蛋白和冻干保存方法相结合。用海藻糖或蔗糖做冻干保护剂，可在长期保存中保持脂质体包封血红蛋白形态稳定，达到“即用型”血液替代品的目标。日本研制的NRC（Terumo公司-泰尔茂)主要不良反应是被网状内皮细胞吞噬，抑制网状内皮系统功能，使机体免疫功能受损，易引起感染性休克等。生产成本远高于全血。基因重组血红蛋白（rHb)血红蛋白的化学修饰通过酵母、昆