24液相色谱基础知识 A

Waters中国有限公司培训中心液相色谱教程(一)液相色谱基础知识A©2004WatersCorporation什么是色谱?ƒ色谱法的简称(又叫色层法,层析法),其本质是一种分离分析方法ƒ常见的分离方法–蒸馏–离心–电泳–过滤–超滤ƒ色谱目前最有效的分离方法©2004WatersCorporation色谱法简介ƒ色谱法(Chromatography)溯源–100多年前俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用的实验方法–他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带–Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法)©2004WatersCorporation色谱法简介ƒ色谱法是一种现代的分离方法-不单是分离有色物质-不单是吸附机理ƒ1906年正式命名(见诸文献)ƒ20世纪30年代开始广泛研究和应用ƒ高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代©2004WatersCorporation色谱法原理ƒ色谱法的原理–是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离–两相中有一相是固定的,叫作固定相(StationaryPhase),有一相是流动的,称为流动相(MobilePhase),流动相又叫洗脱剂,溶剂ƒ相(Phase):–物理化学术语,特指在某一系统中,具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面©2004WatersCorporation色谱法原理分离是一个物理过程。固定相(StationaryPhase)流动相(MobilePhase)进样(Injection)洗脱(Elution)相互作用(Interaction)©2004WatersCorporation色谱法的分类ƒ按流动相的物态分:–气相色谱(GasChromatography,GC)用气体作为流动相(又叫载气)–液相色谱(LiquidChromatography,LC)用液体作为流动相(又叫洗脱剂)ƒ按固定相的形态分:–平面色谱ƒ纸色谱ƒ薄层色谱–柱色谱©2004WatersCorporation色谱法分类示意图色谱液相色谱柱色谱纸色谱薄层色谱高效液相色谱HPLC气相色谱©2004WatersCorporation色谱法的分类ƒ按流动相和固定相的相对极性分:–正相色谱(NormalPhaseChromatography)ƒ固定相的极性大于流动相–反相色谱(ReversedPhaseChromatography)ƒ固定相的极性小于流动相ƒ有机化合物的极性–分子间作用力(静电引力,偶极力,色散力,氢键力…)综合表现的一种描述ƒ注意:此分类法仅适用于液相色谱©2004WatersCorporation有机化合物极性示例CH3COOCH3溶剂样品的官能团极性非极性水甲醇异丙醇乙腈THF乙酸乙酯CH2Cl2CHCl3己烷NH3X/ArOH/RCOOHCNH2ROHRCN醛/酮N(R)2NO2卤代烷烃烷烃©2004WatersCorporation色谱法的分类ƒ按分离过程的机理分:–吸附色谱(AbsorptionChromatography)ƒ根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离–分配色谱(PartitionChromatography)ƒ分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同–离子交换色谱(IonExchangeChromatography)ƒ根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC)–体积排除色谱(SizeExclusionChromatography)ƒGPC(GelPermeationChromatography)–固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂ƒGFC(GelFiltrationChromatography)–固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液©2004WatersCorporation什么是HPLC?ƒ高效液相色谱法–HPLC(HighPerformanceLiquidChromatography)–是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段:ƒ高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器…–广泛应用于各个领域:ƒ医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业…–无论在技术上,理论上,还是在应用上仍有较大的发展空间©2004WatersCorporation什么是UPLC?ƒ超高效液相色谱–UPLC(UltraPerformanceLiquidChromatography)–是区别于HPLC的液相色谱新领域–基于小颗粒填料和LC原理的一种创新方法–实现超高分离度、灵敏度、分析速度–是Waters公司对液相色谱的新贡献(2004年3月正式推出)©2004WatersCorporationHPLC的流程溶剂(流动相)泵进样器色谱柱(固定相)检测器废液数据系统©2004WatersCorporationHPLC的图形结果色谱图(Chromatogram):色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间←色谱峰时间(分)基线↓峰高峰宽响应值©2004WatersCorporation液相色谱图名词术语(1)ƒ色谱图名词术语:–色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号–峰底(PeakBase):峰的起点与终点之间连接的直线–峰高(PeakHeight):峰最大值到峰底的距离–切线峰宽(PeakWidth):在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离–半(高)峰宽(PeakWidthatHalfHeight):通过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧相交两点之间的距离©2004WatersCorporation液相色谱图名词术语(2)ƒ色谱图名词术语:–峰面积(PeakArea):峰与峰底之间的面积,又称响应值–标准偏差(σ)(StandardError):0.607倍峰高对应峰宽的一半–拖尾峰(TailingPeak):后沿较前沿平缓的不对称峰–前伸峰(LeadingPeak):前沿较后沿平缓的不对称峰–鬼峰(GhostPeak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰©2004WatersCorporation液相色谱图名词术语(3)ƒ色谱图名词术语:–基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号–基线飘移(BaselineDrift):基线随时间定向的缓慢变化–基线噪声(N)(BaselineNoise):由各种因素所引起的基线波动–谱带扩展(BandBroadening):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象©2004WatersCorporation液相色谱图名词术语(4)ƒ色谱图名词术语:–死时间(t0)(Deadtime):不被固定相滞留的组分,从进样到出现峰最大值所需的时间–保留时间(tR)(Retentiontime):组分从进样到出现峰最大值所需的时间–死体积(V0)(Deadvolume):不被固定相滞留的组分,从进样到出现峰最大值所需的流动相体积–保留体积(VR)(Retentionvolume):组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积©2004WatersCorporation液相色谱的应用（1）ƒ“分析型液相色谱”ƒ目的:得到数据-定性及定量分析–灵敏度的要求–样品的复杂性–样品量的要求–精度及准确度的要求–容易使用©2004WatersCorporation液相色谱的应用（2）ƒ“制备型液相色谱”ƒ目的:得到纯品-分离及纯化–化合物的稳定性–样品的复杂性–制备量的要求–纯度的要求，及纯度的鉴定–方法的安全性©2004WatersCorporationHPLC的系统组成-硬件ƒ流路系统:–泵(515,1515,1525,600,616,626…)–进样器(7725i,717Plus…)–色谱柱(SymmetryC18,NovaPakC18,…)–检测器(2487,2996,2475,2414,2420,EMD…)–2695/2795分离单元(溶剂管理与样品管理集成为一体)©2004WatersCorporationHPLC的系统组成-软件ƒ数据系统:–积分仪(746)–工作站(PC800)–数据管理系统(基于Oracle关系型数据库和Windows2000/XP操作平台)ƒBreezeƒMillennium32ƒEmpower–Masslynx4.0软件平台(用于液质联用系统)©2004WatersCorporationWaters的HPLC系统(1)ƒAlliance系统:–2690/5分离单元–色谱柱(SymmetryC18)–2996(2487)检测器–Empower色谱管理系统©2004WatersCorporationWaters的HPLC系统(2)ƒ1525-717(7725i)-2487-Breeze系统©2004WatersCorporationWaters的HPLC系统(3)ƒ液质联用系统:2695-2996-ZQ4000-Masslynx4.0©2004WatersCorporationWaters的HPLC系统(4)ƒ氨基甲酸酯分析系统:2695-柱后衍生装置-2475-Empower色谱管理系统