重组载体的构建

重组载体的构建重组载体的构建生物秀生物秀— —专心做生物！专心做生物！生物秀论坛生物秀论坛--学术交流学术交流,,资源共享资源共享,,互助社区互助社区实验目的和要求学习和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法;学习和掌握从PCR产物中回收DNA片段的方法,并了解从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的有关技术;本实验采用粘末端连接法将PCR扩增的DNA片段插入到pBluescriptKS质粒载体中，掌握DNA重组方法。通过本实验了解DNA重组技术在分子生物学研究中的重要意义。实验原理实验原理l多聚酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)原理类似于DNA的变性和复制过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。lPCR反应系统的组成引物、寡核苷酸、TaqDNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。材料与试剂材料与试剂lPCR仪、台式离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、一次性塑料手套等lTaKaRaTaq(5U/ul)l10XPCRBuffer(Mg2+Plus)ldNTPMixture(each10mM)l模板(10ng，质粒模板或DNA或cDNA模板)l引物（Primer1and2,10uM)Primer1:CGCGGGCAGTCTATCTAATCCAGTGGACTCAAGTm=65℃Primer2:TGCAGCCTAGATCCATGGCATCAATGCAGAAGCTm=68℃lpBluescriptKS质粒(3.0kb)lBamHI、HindIII限制酶及10×KbufferlT4DNAligase及其缓冲液(Takara,350u/ml)实验方法和步骤PCR扩增PCR产物的纯化PCR产物以及空载体的酶切乙醇沉淀电泳检测连接160C过夜实验步骤实验步骤lPCR反应体系模板DNA0.5ul(10ng)引物10.5ul(10uM)引物20.5ul(10uM)dNTPs2ul(2.5mM)TaqDNA聚合酶0.5ul(5U/ul)10×缓冲液(Mg2+)2.5ul去离子水18.5ul总反应体系25ul94℃变性5min后，开始以下循环：94℃变性反应45s65℃退火反应45s72℃延伸反应1min最后72℃反应7min，4℃冷却2525--3030个循环个循环PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR产物电泳检测产物电泳检测lPCR产物分析取5－10ulPCR产物，采用1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。l学生PCR实验结果A.从PCR产物中直接回收纯化DNA(Promega公司)1)直接加100μl纯化缓冲液于1.5ml离心管，再加入30～300μlPCR反应物，Vortex混合；2)加入1ml树脂轻轻Vortex3次，每次间隔1分钟；3)进入C步骤。回收PCR产物常采用两中方法，即直接回收和从凝胶中回收，目前有许多公司出售相关的试剂盒。DNA回收纯化B.从琼脂糖凝胶回收纯化DNA1)用琼脂糖凝胶分离PCR片段，用UV观察EB染色条带；2)用干净的刀片切出所需DNA条带，注意要在长波长（≥300nm）UV灯下操作，并快速操作，以免损伤DNA。应尽可能多地去除琼脂糖凝胶，一次操作可切取多至300mg的条带；3)将300μl(300mg)琼脂糖条片转移至1.5ml离心管。直接在70℃温育直至凝胶全部溶化（一般可按公司提供的说明书进行）；4)加1ml树脂，彻底混合20秒，但不用Vortex；5)下接C步骤。C.纯化步骤1)将取出拉杆的注射器筒（3ml）装在纯化柱上，加入上述DNA与树脂混合液，然后装上拉杆，慢慢将混合液推进纯化柱内；2)卸下注射器筒，拔出拉杆，再将注射器筒装上纯化柱，加2ml80%的Isopropanol,然后装上拉杆，慢慢推出液体以清洗柱子；3)再次卸下注射器筒，将纯化柱装在1.5ml离心管上，10000g离心2min，以干燥树脂；4)再将纯化柱装在一个新的1.5ml离心管上，加50μl水或TE缓冲液，1分钟后，10000g离心20秒，溶出DNA片段；5)移去纯化柱，将纯化出的DNA溶液在-20℃下保存备用。D.说明若向1ml树脂中加入500bpPCR产物50ng至16μg，其回收率可在95％以上。同样500bp，若从低溶点琼脂糖凝胶中回收其回收率在70～90％之间。学生PCR实验结果(4ml)PCR产物纯化后(相当于0.8ml原PCR产物）pBluescript酶切后PCR纯化并酶切后(2ml) 3kb=62.5ng 1kb=21.0ngDNA重组本实验是将具有BamHI和HindIII粘性末端的基因片段以及载体通过DNA连接酶连接起来。方法1（酶切后乙醇沉淀，适于PCR产物的重组）：1)在灭菌的Eppendorf管中加入制备pBluescriptKS空载体0.2-1µg(针对本实验，取4ml约800ng)，2 µl10×酶切缓冲液，BamHI&HindIII酶各0.5-1µl（各2.5-5单位），用无菌双蒸水加至20µl反应体系，于37℃保温1-3h；2)在另一管中加入待插入的DNA片段（纯化的PCR产物）0.2-1µg(本实验约为4-10µl)，2µl10×酶切缓冲液，HindIII和BamHI酶各0.5-1µl（各2.5-5单位），用无菌双蒸水加至20µl反应体系，于37℃保温1-3h；操作步骤3)根据实验情况而定，完毕后各取3µl酶解液做电泳分析，观察酶解是否完全）将酶解液加入2倍体积的100％乙醇以及1/10体积的3MNaAC(pH=5.2)，置-20℃冰箱20-30min。4oC，12,000r／min离心10min，弃上清，加入100ml70％乙醇(洗涤沉淀物)，离心去上清，室温干燥DNA沉淀15分钟左右，加入10 µl水或TE缓冲液溶解DNA；4)完毕后各取2µlDNA做电泳分析，0.8-1.5%琼脂糖凝胶，进行初步定量（同时还可以观察载体的酶切结果）。5)将酶切后的2个DNA片段（有时需要在70oC加热15分钟使酶失活及酚氯仿抽提），然后按载体：待插入DNA片段＝1：2（摩尔）混合于一管中（载体可用50-100ng，对于本实验约1 µ l载体，2 µlDNA片段，根据电泳结果来判断），加入T4DNA连接酶缓冲液1µl，最后加T4噬菌体DNA连接酶1µl(5单位)，一般掌握在总体积10 µl，于16℃保温14～16h（过夜），应迅速作转化实验，如遇到特殊情况，可先置于-20oC保存。然后，通过转化细菌来鉴定反应连接产物。将质粒按照方法1所述过程进行酶切、电泳鉴定，然后将酶切后的载体以及目的片段从凝胶中回收纯化，将纯化后的产物按载体：待插入DNA片段＝1：2（摩尔）混合于一管中，之后按方法1中的过程进行连接、转化等。方法2（需要酶切后纯化，可以用于从一个质粒亚克隆到另一个质粒）：