微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的Vc含量2011版

微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的Vc含量(中山大学化学与化学工程学院，广州，510275)摘要本实验采用微波辅助萃取法快速萃取水果中的Vc，以3%的乙腈-0.05mol/LKH2PO4水溶液作为流动相，采用高效液相色谱法对Vc进行定量定性分析。实验中通过对比保留时间进行定性，定量分析采用校准曲线法，校准曲线的绘制表明Vc浓度在5-100mg/L范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系，检测结果准确。该方法具有试剂用量少、操作简单、分析速度快、结果准确等特点。关键词微波辅助提取高效液相色谱维生素C1.引言维生素C（VitaminC，Vc）又叫抗坏血酸，有酸味，溶于水，稍溶于乙醇，不溶于乙醚、氯仿、苯、石油醚、油类和脂肪。维生素C受光照则逐渐变为褐色，干燥状态下在空气中相当稳定，但若空气存在于溶液中则迅速氧化变质[1]。研究表明，Vc在体内参与多种反应，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用，人体内缺乏Vc时容易导致坏血病。Vc是一种水溶性的强有力抗氧化剂并参与胶原蛋白的合成，它同时还具有防癌、预防动脉硬化、治疗贫血、抗氧化和提高人体免疫力等功效。Vc在蔬果中普遍存在，尤其是柑桔类水果中含量较高。樱桃、番石榴、辣椒、猕猴桃等水果中Vc含量在50-300mg/100g。[2]下图是Vc的结构：图1维生素C的分子结构式分析维生素C的方法大致有以下几类：2，6-二氯靛酚滴定法、梯度比色法、荧光分析法、电位测定法、分光光度法等等，各种方法各有特点，有些方法要求的实验条件和操作技术较高，而有些方法步骤烦琐，不利于快速分析。在近几年的Vc研究中较常见的方法是高效液相色谱法。该方法具有较高的准确度、精密度和灵敏度，而且简便快速，更加适用于维生素C的测定。[3]本实验采用微波辅助萃取法快速萃取蔬果中的Vc，采用高效液相色谱进行分析，以Vc校准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做校准曲线，根据样品中Vc的峰面积，由校准曲线计算其浓度。2.实验部分2.1仪器试剂2.1.1仪器高效液相色谱仪：LC-201AT；微波萃取仪（上海新仪微波化学科技有限公司）；色谱柱：依利特或PhenomenexC18柱(250mm×4.6mm，I.D.5μm)。2.1.2试剂乙腈（色谱纯），冰乙酸，维生素C，磷酸二氢钾等均为分析纯；小西红柿、桔子或西红柿样品。实验用水为超纯水。Vc标准溶液：快速准确称取0.025gVc，用1mol/L乙酸溶液溶解，定量转移至250mL容量瓶中，用1mol/L乙酸溶液定容，得到100mg/L标准溶液备用，现用现配。2.1.3色谱条件流动相：3%的乙腈-0.05mol/LKH2PO4水溶液（v/v）；流速1mL/min；柱温为室温，紫外检测波长265nm；进样量10μL。2.2实验步骤2.2.1按操作说明开启液相色谱仪，设定方法参数。2.2.2校准曲线绘制：分别配制5，20，50，80，100mg/L的Vc样品溶液，待液相色谱稳定后进样分析。以Vc色谱峰面积对浓度作图，绘制校准曲线。2.2.3样品准备：准确称取小西红柿5.0006g、桔子5.0024、西红柿5.0220以1mol/L乙酸50mL为萃取溶剂，微波功率设为自动，萃取时间为5min，萃取温度设定为50℃，平行萃取两次。萃取液过滤后用1mol/L乙酸溶液定容至100mL，制成供试品溶液。2.2.4定性分析：分别取10μL50mg/L的Vc标准溶液和供试品溶液，进HPLC分析。根据保留时间定性分析蔬果中的Vc。2.2.5定量分析：供试品溶液经0.45μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。平行测定2次，记录其Vc的色谱峰面积，根据校准曲线计算蔬果样品中Vc的含量，结果以mg/100g表示。3.实验结果与讨论3.1实验结果3.1.1校准曲线的绘制表1标准溶液的浓度及对应的峰面积浓度c/mg·L-15205080100保留时间t/min2.7712.7672.7822.8062.836峰面积A178151765478189245129599513869048根据峰面积对浓度描点，曲线拟合后得到以下校准曲线。02040608010005000001000000150000020000002500000300000035000004000000Y=38228X-16642R2=0.9988图2Vc峰面积-浓度校准曲线由图看出，所得校准曲线方程为：峰面积A=38228c/mg·L-1-16642，相关系数R2=0.9988。3.1.2样品提取液色谱图分别以小西红柿、桔子、西红柿四种水果的提取液为样品，在如下色谱条件“流动相：3%的乙腈-0.05mol/LKH2PO4水溶液（v/v）；流速1mL/min；柱温为室温，紫外检测波长265nm；进样量10μL”下检测，得到色谱数据和色谱图如下：峰面积浓度/mg·L-102460200004000060000800001000002.787/460313Intensityt/min图3小西红柿提取液HPLC色谱图024601000020000300004000050000600002.812/218763Intensityt/min图4桔子提取液HPLC色谱图0246-500005000100001500020000250002.804/113045intensityt/min图5西红柿提取液HPLC色谱图3.1.3数据处理根据峰面积A=38228c/mg·L-1-16642，代入各样品中Vc色谱峰的峰面积，求出检测液浓度；转换成各种水果中Vc的含量如下表所示：表2各种样品的色谱数据样品小西红柿桔子西红柿样品质量m/g5.00065.00245.0220保留时间t/min2.7872.8122.804峰面积460313218763113045Vc浓度c/mg·L-112.486.1583.392*Vc含量mg/100g24.9612.316.754*含量=c×100L1000×100gm3.2讨论3.2.1实验结果：校准曲线的绘制表明，Vc浓度在5~100mg/L范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系（A=38228c/mg·L-1-16642，R2=0.9988）。与校准曲线对比后得出，小西红柿、桔子、西红柿的Vc含量分别为24.96mg/100g、12.31mg/100g、6.754mg/100g。3.2.2系统误差分析。Vc标准溶液的用1mol/L乙酸配制，Vc在酸性环境(pH3.4～4.5)溶液中比在碱性溶液中较为稳定[4]，但仍有部分被氧化的可能，这会造成标准溶液实际所含的Vc量低于标识值，从而导致测定值偏高。另一方面，在样品预处理过程中，部分Vc会被空气中的氧气氧化破坏，从而导致测定值偏低。3.2.3液相色谱法中常用的定性方法有保留值定性和与结构表征检测器联用；常用的定量方法有归一法、校准曲线法、内标法和标准加入法等。本实验采用校准曲线法定量，优点是绘制好校准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从校准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。不足的是，校准曲线法受分析色谱条件的影响很大，容易出现很大的误差，因此实验时要特别注意色谱条件的控制。3.2.4高效液相色谱法按分离机制的不同分为液-固吸附色谱法、液-液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。高效液相色谱分析方法的建立，应考虑两个方面的因素：①选择合适色谱柱。色谱柱是液相色谱分析的核心组件；根据分析对象的性质选取合适的色谱柱，如正相色谱柱、反相色谱柱、离子交换色谱柱等。②流动相。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。选择流动相时应注意的几个问题。a.尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。b.避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。c.试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。d.流动相同时还应满足检测器的要求。3.2.5物质的提取方法可以采用传统索氏抽提法，如从茶叶中提取咖啡碱。索氏抽提法需经提取、纯化、分析等诸多步骤，耗时长，正逐步被一些快速、低溶剂消耗、自动化的技术所代替。其中，微波辅助提取技术是诸多技术中发展较快的一项技术。由于微波具有穿透到物质内部的本领，能做到被加热的物体里外同时加热，这就大大缩短了加热时间。微波的这种加热速度快、均匀特点使得使用微波辅助提取技术时，消耗时间比传统方法明显减少了，同时成品消耗、原料、工作量、试剂量等都有显著的减少[5]，故本实验使用微波辅助提取法提取水果样品中的Vc，以缩短实验时间并提高分析速度和效率。3.2.6常用的色谱法主要有气相色谱法和液相色谱法。其中气相色谱需要在高温下进行，流动相为有限的几种“惰性”气体，主要适用于沸点较低、反应活性较差、热稳定性很好的物质，因此蔬果中Vc不能选用气相色谱进行分析。本实验采用高效液相色谱法，该方法具有检测灵敏度高、检测速度快、分辨率高、试样用量少等优点，适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。本实验是为了测定水果中Vc的含量，由于Vc的熔点为190~192℃，很难挥发，又在水果中含量比较低，适宜使用液相色谱法分析。3.3结论微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的Vc含量，具有试剂用量少、灵敏度高、操作简单、分析速度快、结果准确等特点，是一种合理有效的检测方法。4.参考文献1郑集，陈钧辉.普通生物化学(第三版)[M].北京：高等教育出版社.1998，236-2392陈六平，邹世春.现代化学实验与技术.北京：科学出版社，20073孙义.水果和蔬菜中维生素C含量的测定方法综述.天津化工，2008，22(3):58-594康丽英.影响维生素C稳定性因素的研究.中国药业.1996，075潘学军，刘会洲，徐永源.微波辅助提取(MAE)研究进展.化学通报，1995，5，7-14