第四讲-蛋白质的化学修饰

第四讲蛋白质的化学修饰一、概述指在温和条件下，蛋白质侧链基团与化学试剂形成专一性共价键的反应。涉及蛋白质侧链及修饰剂的反应性两个方面化学修饰的意义改造蛋白质，改善其功能性质，使适用于更广泛领域；科学研究，例如酶的活性中心，致病性，药物生物大分子相互作用、药物设计等。⒈蛋白质功能基的反应性通过X射线分析蛋白质所得的数据显示，多数非极性侧链位于蛋白质分子的内部，而大部分极性侧链则位于其表面。蛋白质分子表面不规则，极性也不相同。蛋白质功能基所处的微环境强烈影响它的物理和化学性质，同时也影响参与修饰的化学试剂接近，从而显著影响对该功能基的化学修饰。•就目前的研究成果来看，蛋白质的修饰反应都是亲核反应。即与参与修饰的化学试剂是富电子的，进攻蛋白质侧链基团的缺电子部分，反之亦然。特别注意：被修饰蛋白质侧链基团的亲核性与其pK值相关。影响蛋白质侧链基团pK值的因素有：⑴微区极性决定基团解离状态的关键因素之一。例如，溶菌酶中第Glu35的γ-羧基在水溶液中的pKa=5.9；当其与抑制剂三-N-乙酰氨基葡萄糖结合后，此时Glu35的γ-羧基pKa=6.4，上升了0.5。可能是由于抑制剂的加入，改变了该酶的构象，使该残基微区极性降低之故。蛋白质构象改变会导致微区极性的局部改变，这种改变对Trp，Met和Cys的反应性影响最小;对氨基和咪唑基的反应性影响较大;而对Tyr，Hcys和COOH的反应性影响最大。此外，极性的变化也影响到反应类型。⑵氢键效应氢键对维持天然蛋白质及其离子稳定性有重要影响，氢键的变化也可能导致pK发生改变。例如2-氯酚pK比2-溴酚pK值高0.7pH单位，这是由于氯与酚基形成氢键的能力比溴强。水杨酸的羧基可与其酚基形成氢键，结果使其羧基的pK值比正常值小1个pH单位，同时使酚基的正常pK10改变到pK13，因此，在蛋白质的酚基-羧基相互作用中，羧基的pK值应比正常值低，而酚基的pK值高于正常值。OClHOHBrCOO-NH2HOPro⑶静电效应蛋白质中组氨酸残基的pK值是不同的。例如，碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基，pK值分别是：碳酸酐酶：5.916.047.007.23葡萄球菌核酸酶：5.375.715.746.50组氨酸在这两个蛋白质中的pK值范围是5.37～7.23，几乎相差2个pH单位，可能是邻近带电基团相互影响所致。总之影响蛋白质可解离氨基酸侧链pKa值、可影响这些侧链基团的反应性。蛋白质功能基的微区状态不同，反应性不同。功能基反应性差异可通过竞争标记法来测定。⑷位阻效应蛋白质表面的侧链基团旁有烷基等较大基团时，有基团空间位阻，影响与修饰剂接近及反应。例如，枯草杆菌蛋白酶的所有10个Tyr残基均在分子表面，而且其酚羟基几乎都不形成氢键。对它进行彻底硝化和碘化，10个Tyr中也只有8个被修饰，这很可能是空间障碍所引起的。此外，电荷转移，共价键形成，金属鳌合等都会改变蛋白质功能基的反应性。⒉蛋白质功能基的超反应性超反应性是指蛋白质中的某侧链基团与某试剂发生反应的能力。超反应性基团一般与蛋白质的某种功能性有关。超反应基团并不一定在酶的活性中心。例如，木瓜蛋白酶中的19个Tyr残基中只有一个能与二异丙基氟磷酸反应，该残基被修饰后并不一定使酶活性发生改变。•影响超反应性的因素很复杂•包括；⑴功能基的pKa；⑵功能基的亲核性；⑶吸引试剂并使其适当取向的能力；⑷功能基所在区域与修饰剂的立体化学适应性。•⒊修饰剂的反应性•蛋白质的构象和表面特性既影响氨基酸侧链的反应性，也可能对接近功能基的修饰剂产生影响。修饰剂修饰蛋白质反应的活性由以下因素所决定：⑴选择吸附修饰剂与蛋白质功能基之间的选择性吸附越强，反应性越大。⑵静电相互作用带电荷的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的某一残基定位。CHCNNHCHCH2CHN+H3COO-ICH2COOHCONH2ICH2•例如，用碘乙酸和碘乙酰胺对His咪唑基烷基化的速度和烷基化部位的差异就是由于静电作用造成的。（His的N-1或N-3的烷基化）⑶位阻因素蛋白质表面的位阻，或底物、辅助因子、抑制剂产生的位阻都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。例如，α-溴代丁酸可烷化核糖核酸酶His12，而且反应很快；若用α-溴代戊酸修饰，则很难进行反应；α-溴代己酸则不能发生反应，这显然与位阻有关。⑷催化因素修饰部位附近的其它功能基，若有酸碱催化作用，也能影响修饰反应。例如，对硝基苯乙酸盐和苯乙酸盐以同一机理对胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸进行乙酰化，但苯乙酸盐反应性差，这与酶的酸碱催化有关。硝基苯乙酸盐对丝氨酸酶的反应性较高，这与Ser附近的路易斯碱与羧酸羟基氢作用，削弱该氧原子对羧基碳的吸电子相互作用有关。SerOHOCH2CH2HONO2C⑸局部环境的极性溶剂极性可能与反应速度有关，如下表：反应类型降低极性对速度的影响⒈RSR+ICH2CONH2[R2S+CH2CONH2]I-适当或大大降低⒉RSR+H2O2R2SO+H2O没有影响⒊RS-+ICH2CONH2R2SCH2CONH2+I-没有影响⒋RN+H3+OCN-RNHCONH2适当或大大增加疏水环境能阻止产物电荷分离的反应（反应1），并能加速电荷中和的反应（反应4）；对于反应2（没有电荷分离）和反应3，电荷只是从一个离子转移到另一个离子，则介质是的极性是不重要的。二、化学修饰的方法学进行蛋白质修饰时，首先是选择修饰剂和修饰条件，以期提高修饰反应的专一性，获得满意的修饰结果。其次，在修饰反应过程中，要建立适当的方法追踪反应进程，以获得与修饰有关的数据。然后分析获得的数据，确定修饰部位和修饰程度，提出对修饰结果的合理解释。一、控制修饰反应的专一性探索性研究时，对修饰对象的了解不多，所以选择修饰剂和修饰条件至关重要，选择的正确性直接影响到修饰反应的专一性和有效性。⒈试剂选择不同实验，对修饰的专一性要求也不同，因此选择试剂在很大程度上要依赖修饰目的。例如，对氨基的修饰，仅修饰氨基；仅修饰α-氨基；修饰暴露的或反应性高的氨基。一般通过选择试剂和反应条件来控制修饰的部位和程度•如果希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，应该选择能引入最大电荷量的试剂。•例如用顺丁烯二酸酐可将中性的巯基和酸性条件下带正电荷的氨基转变成在中性pH下带负电荷的衍生物。CH2CH2CCOOOH2NPro+CH2CH2CCOO-ONHPro修饰对有机溶剂不稳定的蛋白质，必须在水介质中进行，应选择在水中有一定溶解度的试剂。在选择试剂时，应考虑反应生成物容易进行定量测定，即有特殊的光吸收或同位素标记等。选择试剂时，应注意其体积，体积过大，引起的空间障碍大,而不能或不易与作用的基团接近。一般而言，试剂体积较小为宜。选择试剂时，应该考虑修饰反应要达到的程度；修饰后蛋白质构象是否基本保持不变；是否需要分离修饰后的衍生物，反应是否需要可逆等因素。总之理想的修饰酶活性部位氨基酸残基的试剂应该具备以下特征:即选择性地与一个氨基酸残基反应；反应须在酶蛋白不变性的条件下进行；标记的残基在肽中稳定，易通过降解分离并进行鉴定；反应程度可用简单的技术测定。但是，一种试剂往往不能同时满足上述所有条件，所以必须根据具体实验要求进行取舍。⒉选择反应条件修饰蛋白质的反应条件，除允许修饰反应能顺利进行外，还必须满足：不造成蛋白质的不可逆变性;有利于专一性修饰蛋白质。为此，应尽量控制反应的温度、pH值、反应介质和缓冲液等，以保证蛋白质特定空间构象尽量不变。⒊反应的专一性专一性对蛋白质的化学修饰至关重要，用以下途径可以保证修饰的专一性：⑴选择专一性试剂蛋白质分子的特殊空间结构能影响其某些基团的活性。例如DFP能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸作用，导致酶迅速失活。CH3CHFPOH3CCH3CHCH3CH3CHHFPOH3CCH3CHCH3EnzymeSerHO+EnzymeSerO+⑵选择不同的反应pH均受pH的影响，控制反应pH值，可调控蛋白质分子各功能基的解离程度，从而控制修饰反应的专一性。例如，用碘乙酸或其酰胺可与半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸的侧链及α-氨基、ε-氨基发生作用；pH6时，它只专一的与组氨酸的咪唑基作用；pH值为3时，专一与Met作用（在酸性下，巯基和氨基都呈正离子，不活泼）。ICH2COOH+蛋白质-SH蛋白质-S-CH2COO-+H++I-(pH＞7)ICH2COOH+蛋白质-S-CH3蛋白质-S（-CH3）-CH2COO-+I-(pH3)ICH2COOH+蛋白质-NH2蛋白质-NH-CH2COO-+H++I-(pH＞8)ICH2COOH+蛋白质-His蛋白质-His（N-CH2COO-）+H++I-(pH6)⑶利用某些产物的不稳定性高pH下，用氰酸、二硫化碳、O-甲基异脲和亚氨基酸等可转变氨基成脲和胍的衍生物。虽然巯基也能与上述试剂作用，但因pH高，形成的产物迅速被分解。⑷亲和标记亲和试剂先以非共价键结合到蛋白质的活性部位，再发生化学作用。因此亲和标记试剂必须与蛋白质作用的底物或抑制剂相似，可顺利到达修饰位点，而且还能与特定活性基团反应。例如，利用对甲基苯磺酸氯（CH3-C6H4-SO2Cl），就能作用于胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸上。⑸差别标记以底物或抑制剂保护蛋白质的活性部位基团，使其不能与修饰试剂作用，可修饰非必需基团。然后将过量的底物或抑制剂除去，获得部分修饰的蛋白质。将其与同位素标记的同样试剂作用，则获得带有放射性同位素标记的蛋白质活性中心基团。⑹利用蛋白质状态的差异在不同状态下，蛋白质的构象有差异，暴露的基团也不同，因此在不同状态下修饰，可获得相关信息。例如，在结晶状态下修饰，可提高修饰的专一性。核糖核酸酶在晶体状态下进行羧甲基化时，反应主要集中在His119，而对His12的修饰则很少，两者之比为60∶1；在溶液中该反应的比例为15∶1。二、确定修饰程度和修饰部位通过对被修饰蛋白质的降解和氨基酸分析后鉴定修饰部位。通过纯化被修饰蛋白质的氨基酸及其衍生物，测定其同位素标记量或光谱强度或顺磁共振谱或荧光标记量等来确定反应程度。一般认为：测定被修饰的氨基酸，要比测定氨基酸的减少量更准确。三、化学修饰数据的分析⒈化学修饰的时间进程曲线以修饰时间对蛋白质活性作图可以了解修饰残基的性质和数目，修饰残基与蛋白质活性的关系，实际上是蛋白质失活速度常数的测定若蛋白质活性仅与某个残基有关，则可用公式（后面）表示LogE1/E0=-K失活·tE1为时间t时的活力，E0为初始活力，E1/E0为时间t时的残余活力用残余活力的对数对时间作图，即可求出失活的速度常数斜率=-K失活/2.3logE1/E0min若蛋白质活力与两个以上的残基有关，而且与修饰剂反应速度不相同，可获得多相修饰半对数图斜率=-K失活/2.3logE1/E0min⒉确定必需基团的性质和数目蛋白质分子中某些侧链基团在功能上虽有必需和非必需之分，但它们往往都能与某一试剂起反应。1961年Ray等提出用比较一级反应动力学常数来确定必需基团的性质和数目的方法，但是该法的局限性大，现基本被放弃。1962年，邹承鲁提出更具普遍应用意义的统计学方法，即邹氏作图法该法认为：当试剂仅作用于蛋白质分子中一种基团，而且必需基团和非必需基团与试剂作用的速度相同时，活力变化与修饰残基之间有如下关系：α1/i=X；[x=（n-m）/n]α为实验测得的平均活力剩余分数，x是基团的保留分数，n为蛋白质分子中可被修饰的基团总数，m为已被修饰的基团数。当n为已知时，x可由实验测得的m值计算而得。由上式两边取对数，以logα对logx作图得直线，其斜率即为必需基团数i。当n为未知时，x无法求得，但可根据上式给定一系列的i值（1，2，3……）。使得α1/i对m作图为一直线的那个i值。m蛋白质分子中的必需基团和非必需基团与修饰剂的作用速度明显不同，假定该基团总数为n，并将其分为三类；一类