第五章-核酸分子杂交技术

核酸分子杂交（DNA/DNAorDNA/RNA）核酸分子杂交技术：具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链。探针(已知核酸片断，单链)待测核苷酸序列(单链)核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（CarnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。核酸分子杂交的基本原理DNA变性•方法热变性：90~100℃酸碱变性：常采用碱变性化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等•特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度(meltingtemperature,Tm)DNA复性或杂交(hybridization)•DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等影响杂交的因素核酸分子的浓度和长度•浓度大，复性快；分子量大，复性慢温度离子强度杂交液中的甲酰胺核酸分子的复杂性非特异性杂交反应•预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNA分子杂交的基本方法Southern印迹法Northern印迹法Western印迹法原位杂交斑点印迹杂交液相杂交SouthernDNA印迹杂交SouthernDNA印迹杂交使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由英国人EdwinMellorSouthern于1975年首先设计出来的，故又叫Southernblot。Southern杂交(Southernbloting)的主要步骤待测DNA样品的制备、酶切待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳凝胶中DNA的变性：碱变性Southern转膜：•硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜•毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法探针的制备Southern杂交杂交结果的检测（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片DNA凝胶电泳SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列利用非放射性探针检测核苷酸主要应用•1.遗传病诊断•2.DNA图谱分析•3.PCR产物分析NorthernblotNorthern杂交*1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。也称为Northern印迹（NorthernBlot），用以检测某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表达量。*因这种方法与Southernblot杂交技术十分类似，与DNA的杂交（Southern杂交）相对应，被趣称为Northern杂交。Northern印迹杂交1、基本原理和基本过程与Southernblot基本相同2、鉴别RNA3、探针可用DNA或RNA片段4、待测样品为总RNA或mRNANorthern印迹与Southern印迹的不同点1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性与Southern印迹杂交不同之处：RNA电泳避免单链RNA自身形成高级结构和自身降解变性凝胶电泳(甲醛、尿素、甲酰胺等)RNase抑制环境2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理3、靶核酸为RNAWestern杂交印迹法(Westernbloting)检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法主要步骤：•蛋白质样品的制备•SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳•蛋白质的电转移：NC膜•靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应显色反应：酶促反应InSituHybridization原位杂交原位杂交(insituhybridization)*细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。*细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA杂交。特点•能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究•不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高•能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态原位杂交1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA杂交•保持组织细胞的形态•对核酸无抽提，修饰与降解作用•不改变核酸在组织细胞内的定位•不阻碍核酸与探针的杂交过程•对杂交信号无遮蔽作用•理化性质稳定2、杂交过程：（1）组织或细胞的固定理想固定液应具备：（2）组织细胞杂交前的预处理•去垢剂（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白质•组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体•控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落（3）探针的选择与标记•以获得最好杂交效果为依据选择探针•探针的长度一般为50~300bp,有时达1.5kb•放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定检测结果分辨率高，但信号检测时间长•非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易于观察（4）杂交•杂交液体积小：10~20μl•cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃•杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜•杂交前一般将组织切片置95℃5~15分钟使DNA变性•冲洗温度一般不超过50℃（5）杂交结果检测•所用探针为核素标记,放射自显影检测•所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测斑点及狭缝印迹杂交1、斑点印迹为圆形2、狭缝印迹为线状3、鉴别DNA、RNA4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量斑点印迹杂交(dotbloting)将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上优点：简单、快速、可同时检测多个样品液相杂交指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。（一）RNA酶保护分析法1、RNA酶保护分析法原理RNaseA和RNaseT1专一水解杂交体系中的单链RNA，不水解探针RNA与待测RNA互补形成的双链RNA，使杂交分子得到保护，称RNA酶保护分析法。2、杂交过程•制备待测RNA•RNA探针的制备与标记：体外转录法制备和标记RNA探针•杂交：待测RNA与RNA探针在液相中杂交•RNaseA和RNaseTI除去单链RNA•电泳分离RNA•放射自显性检测杂交结果（二）核酸酶S1保护分析法1、原理核酸酶S1在一定条件下专一水解杂交体系中的单链DNA和单链RNA，不水解DNA探针与待测RNA杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸酶S1保护分析法2、杂交过程•制备待测RNA：总RNA或mRNA均可•单链DNA探针的制备与标记•杂交：单链DNA探针与待测RNA在液相中杂交•核酸酶S1除去单链DNA和单链RNA•电泳分离DNA/RNA杂交体分子•放射自显影检测杂交结果核酸杂交的探针(1)常用探针类型：①人工合成寡核苷酸探针②基因组DNA探针③cDNA探针④RNA探针(2)探针标记物①放射性标记物32P高放射性半衰期14.3d35S放射性较弱半衰期87.1d3H放射性弱半衰期12.35a②非放射性标记物半抗原：生物素、地高率配体：生物素是亲和素的配体荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素酰化的碱性磷酸酶可使发光底物发光BiotinAvidin(2)探针标记物理想标记物应具备的特性：•高度灵敏性•不影响碱基配对的特异性•不影响探针分子的主要理化性质•对酶促反应活性无影响或影响不大•检测方法具有高度灵敏性和高度特异性BCIP/NBT紫蓝色沉淀Dig抗Dig抗体碱性磷酸酶(3)探针标记方法–切口平移法(nicktranslation)–随机引物法(randomprimer)：六核苷酸残基的引物–PCR标记法–末端标记法1、利用DNaseI在DNA双链上造成单链切口2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中①切口平移法（nicktranslation)①切口平移法(nicktranslationlabeling)5’5’3’3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’3’DNA酶IDNA聚合酶I+标记的dNTP5’3’变性探针平均长度600bp②随机引物法其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中随机引物法所具有的优点：1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题3、标记活性高，标记活性可达108cpm/µgDNA以上4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记②随机引物法(randomprimedDNAlabeling)5’3’5’3’5’3’5’3’随机6-12bp单核苷酸引物变性一般探针长度在400-600bp之间③末端标记法(terminallabeling)3’末端5’末端④PCR标记法⑤光敏标记法生物素、地高辛等光敏基团与生物素结合⑥化学衍生结合标记法转氨标记法等(4)探针的纯化1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是SephadexG-503、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针