纳豆实验论文

纳豆芽孢杆菌的分离纯化及纳豆接种培养黄颖敏2013级生物工程1班201330550107摘要实验通过从纳豆中稀释得到纳豆芽孢杆菌，通过稀释抹布平板法进行一系列的浓度梯度稀释，分离，镜检，培养等一系列的分离纯化过程，得到纳豆芽孢杆菌，取610、710、810这三种浓度的菌液进行培养，从而分析纳豆芽孢杆菌的生长情况。通过对黄豆进行蒸煮、冷却、接种、发酵等一系列操作制作纳豆产品。关键词分离纯化稀释纳豆芽孢杆菌纳豆制作1、前言：分离纯化和选择培养是在微生物的研究中经常用到的基本操作方法，通过本次实验让学生可以掌握微生物分离纯化的操作步骤，掌握微生物简单鉴定方法，同时了解微生物生长状况检测指标等。2、材料：2.1、材料与试剂：黄豆（50g/组）、饭盒（带盖）、接种用纳豆产品、酱油、芥末、筷子、无菌水、灭菌试管、灭菌平皿、250ml三角瓶（带玻璃珠）、250ml三角瓶、100ml量筒、不锈钢锅、电磁炉、试管架、玻璃棒、电子天平、大塑料筐、称量纸、不锈钢大口盅、纱布、大漏勺、1ml枪头、移液枪、橡皮筋、牛皮纸（报纸）、试管塞、三角瓶塞、标签纸、pH试纸、酒精灯、洗瓶、吸水纸、废液缸、涂布棒、接种环、载玻片、10%NaOH、5%HCl、肉汤培养基、95%乙醇、蒸馏水、结晶紫染液、碘液、番红染液、香柏油、二甲苯、擦镜纸2.2、仪器：超净台、恒温培养箱、分光光度计、PH计、显微镜3、方法：3.1、固体发酵接种：固态发酵是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水下溶性固态基质中，用一种或多种微生物的一个生物反应过程。从生物反应过程中的本质考虑，固态发酵是以气相为连续相的生物反应过程。固体发酵具有操作简便、能耗低、发酵过程容易控制、对无菌要求相对较低、不易发生大面积的污染等优点。3.2、分离纯化：研究微生物的基本方法，将某种特定微生物从群体或混杂的微生物群体分离出来的技术称为分离；通过高度稀释或划线方法使得在平板培养基上的某一区域仅存留一个单细胞，并使此单细胞增值成为一个新的群体，该群体称为单菌落，获得单一菌种，此过程即为纯化。3.3、选择培养：由于不同微生物生长条件和对营养要求不同，制备仅适合要分离的微生物生长繁殖的培养基，来培养混合微生物，改变群体中目的微生物的比列，达到分离目的。4、过程：4.1、实验前准备：配置200ml肉汤培养基；制备无菌水20支（各装9ml）；将平皿灭菌。4.2、实验流程：纳豆芽孢杆菌分离纯化：样品稀释→倒平板→涂布→培养→观察菌落纳豆芽孢杆菌观察（革兰氏染色）：样品稀释→涂片→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检纳豆接种培养：黄豆→浸泡→蒸煮→冷却→接种→发酵→成品4.3、实验步骤：4.3.1样品稀释：取纳豆成品10g，放入装有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，震荡摇匀，将细胞分散。采用10倍稀释法，将菌悬液稀释至1-10、2-10、3-10、4-10、5-10、6-10、7-10、8-10不同浓度菌悬液。4.3.2倒平板：将已灭菌的肉汤培养基冷却至40℃~50℃（不烫手为止）倒入已灭菌的平皿中（大约15~20ml）。4.3.3涂布：待平皿中的培养基冷却凝固后，用无菌吸管分别吸取6-10、7-10、8-10浓度菌悬液200L滴在平板培养皿表面中间位置，用无菌涂布器涂布均匀。4.3.4培养：置于37℃恒温培养箱中倒置培养2天。4.3.5革兰氏染色：初染：滴加结晶紫于已干燥固定的载玻片上，染色2min，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上的水甩干。媒染：用碘液媒染1min，水洗。脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，用滴管流加95%乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时（20~30s），立即水洗，种植脱色，将载玻片上的水甩净。复染：在涂片上滴加番红液复染2~3min，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色过程中，不可使染液干涸。4.3.6镜检：干燥后，用油镜观察。由于纳豆芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，理论上应被染成紫色。4.3.7纳豆接种培养：称取黄豆1000g洗净、浸泡过夜，沸水煮沸20min，铺至纱布自然冷却，拌入成品纳豆100g，拌匀，分装至小碗，在30℃下自然发酵2d。5、实验结果：5.1显微镜下观察纳豆芽孢杆菌在油镜下观察到被染成紫色的纳豆芽孢杆菌，呈柱状。5.2纳豆芽孢杆菌的分离纯化三个平板培养皿随着浓度减少菌落的数量明显减少。5.3纳豆接种培养黄豆经过两天培养后水分减少，粘度增加，搅拌时有少量粘丝。6、讨论与分析：1、在显微镜下能清晰地观察到被染成紫色的纳豆芽孢杆菌呈柱状，染色操作和显微镜使用正确。2、平板培养皿中菌落随菌悬液浓度增加而增多，表现在6-10和7-10浓度的培养皿中部有连在一起的大片菌落，而8-01培养皿内菌落均分散生长。参考文献1）纳豆芽孢杆菌固体发酵低温豆粕的功能活性及机制研究，杨学娟；2）纳豆枯草杆菌的筛选和纳豆激酶发酵条件优化，梅乐和；胡升；许静；姚善泾；郑晓冬；3）纳豆的营养保健作用及制作技术，庄志发；赵超；王凤艳；孙玉萍；4）一株纳豆芽孢杆菌分离及鉴定，鞠守勇；肖云；卢洪胜；陈其国；李莉；