定性免疫检验室内质量控制方法

定性免疫检验室内质量控制及质量持续改进李金明国家卫生计生委临床检验中心全国临床免疫检验质量保证大会2016.5.17-19南宁问题？为什么要有室内质量控制（IQC）？IQC就是每批检测时加入一个外部质控品同时检测吗？定性免疫检验与定量检验在室内质控的方法上有何根本性不同吗？定性免疫检验的室内质控品从哪能得到？定性免疫检验的“非统计学方法”与“统计学方法”有矛盾吗？统计学质控方法就是L-J质控图吗？室内质量控制的“失控规则”制定的最根本依据是什么？临床定性免疫检验感染性疾病特异抗原和抗体自身抗体定性免疫检验的报告方式有反应（reactive）、无反应（nonreactive）阳性（反应）、阴性（反应）为什么要有室内质量控制（InternalQualityControl,IQC)？由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实验室工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作。可概括为:1.执行者（Who）：实验室技术人员；2.目的（Why）：①监测实验室测定的精密度（重复性）；②提高常规检测结果一致性（质量的持续改进）；③决定了当批测定的有效性，报告可否发出。是对实验室测定的即时性评价。IQC就是每批检测时加入一个外部质控品同时检测吗？实验室环境条件（温度、湿度、振动、洁净、通风、噪声等）？仪器设备的日常维护和定期校准？试剂方法的性能验证？性能确认？可操作性的SOP（质量管理的“灵魂”）？、人员培训？室内质控品随机放在临床标本中的同时检测？实验室环境条件的控制温度湿度不只是为了仪器设备运行抗原抗体结合反应与环境温度和湿度均有关系实验室仪器设备及管理加样器：维护、校准全自动免疫分析仪：维护、校准荧光显微镜：维护、校准水浴箱：维护、校准酶标仪：维护、校准洗板机：维护离心机：维护生物安全柜：维护冰箱：维护理想的试剂试剂方法的性能验证及每批试剂的质检性能指标：重复性准确性（定量：回收率、标准物质等；定性：方法学比较等）分析特异性测定下限（病原体特异抗体要用转化血清盘）抗干扰能力实验室质量管理的“灵魂”源于一些标准文件（如仪器试剂说明书、国际国内标准文件）和实验室实际工作经验积累。因此高于相关标准文件！！！SOP等于试剂盒说明书吗？标准操作程序（SOP）是实验室的“最高标准”！有可操作性的SOP是质量管理的“灵魂”！定性测定的室内质控方法非统计学方法统计学方法非统计学方法在检测临床标本的同时，检测一定数量（与临床样本的数量相适应）的已知阳性（或存在靶微生物或靶细胞）和阴性的质控样本检测有效的质控判断方法：阳性检测为阳性，阴性检测为阴性。“批（RUN）”的概念在相同的条件下（地点、仪器、试剂、人员、时间）所进行的一组测定。特异抗原和抗体、自身抗体等定性检测质控品从哪来？日常检验阳性样本的收集弱阳性质控品：ELISA、CLIA等（S/CO比值1.5~4.0的样本）；ANA（有临床意义的起始稀释度样本）；LIA（能见到可判断为阳性条带的样本）；基因检测为测定下限浓度2-4倍。较强阳性质控样本？阴性质控品：日常检验的阴性标本ANA均质型1:1001:1601:3201:6401:1000弱阳性样本较强阳性样本每块板质控物的数量及位置至少1份弱阳性质控至少1份阴性质控随机放置于血液标本中间统计质控方法Levey-Jennings质控图方法“假阳性”的统计质控方法Levey-Jennings质控图方法也称Shewhart质控图，是由美国的Shewhart于1924年首先提出，并用于工业产品的质量控制。二十世纪五十年代初，Levey-Jennings将其引入临床检验的质量控制。经Henry和Segalove的改良，即为目前常用的Levey-Jennings质控图。Levey-Jennings质控图Levey-Jennings质控图基本的统计学含义稳定条件下，在20个IQC结果中不应有多于1个结果超过2SD（95.5%可信限）限度；在1000个测定结果中超过3SD（99.7%可信限）的结果不多于3个。如以±3s为失控限，假失控的概率为0.3%。常用质控规则的符号及定义符号定义12S1个质控测定值超出均值±2SD控制限13S1个质控测定值超出均值±3SD控制限22S2个连续的质控测定值同时超出均值+2SD或−2SD控制限R4S同一批测定中，2个不同浓度质控品测定值之间的差值超出4SD控制限41S4个连续的质控测定值同时超出均值+1SD或−1SD控制限7T7个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变化10X10个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧多规则质控Concept1977Example1981“WestgardRules”QCData12s13s22sR4s41s10xReportResultsTakeCorrectiveAction“假阳性”的统计学室内质控方法基于日常检验的阳性率比值(呈正态分布)直接概率计算方法（不呈正态分布）基于日常检验的阳性率比值半Levey-Jennings质控图法质控规则当阴性质控样本为阳性时,不管阳性率测定比值为何，均为失控，所有阳性标本须重新测定，并增加一倍阴性质控样本。如果阴性质控样本为阴性，某次测定阳性比值超出+2SD,则为失控,为1+2S规则。本次结果阴性结果根据阳性质控样本的情况,决定是否可以发出,所有阳性样本结果不能发出，需查找出现阳性率增高的原因，并在增加一倍阴性质控样本的情况下重新检测。直接概率计算法按统计学规律，一个事件发生的概率小于5%被称为小概率事件，即发生的可能性很小。当一个小概率事件发生时，则可能有误差存在，有必要对其发生的原因进行分析。对每天的日常病人结果中阳性率出现的概率进行计算，如果这种结果出现的概率小于5%时，则可判为失控。根据二项式分布的概率计算在一个实验室中某检测项目结果的阳性率为p,计算在n个血液样本中有k个阳性结果的概率。根据二项式分布的概率计算公式如下：P(X=k)=n!/[k!(n-k)!]pk(1-p)n-k(1)其中n为当次实验检测标本数，k为阳性个数，p为阳性率。P(X=k)5%为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳性标本在查清原因后重做。根据二项式分布的概率计算如果一个实验室检测HBsAg，平常病人结果的阳性率为10%，即p=0.1,在某一次检测25个样本出现6个阳性结果，19个阴性结果，则检测过程中是存在污染的可能性可通过下述方法计算。即计算在25个样本中出现6个或6个以上阳性结果的概率，此时的概率为1-（获得0个或1个或2个或3个或4个或多5个阳性结果的概率）即：1-[P(0)+P(1)+P(2)+P(3)+P(4)]=1-[(1-0.1)25+25(1-0.1)240.1+300(1-0.1)230.12+2300(1-0.1)220.13+12650(1-0.1)210.14+53130(1-0.1)200.15]=0.0334则在这个实验室一次检测25个标本获得6个或6个以上阳性结果的概率为3.34%，小于5%，属于小概率事件，即发生的可能性很小，可能有污染所致假阳性结果的可能。根据泊松分布的概率计算在病原体特异抗原和抗体检测中，许多实验室或检测项目如抗-HIV、抗-HCV的阳性结果率均较低，这时虽然可以使用公式（1）计算概率，但如果标本量很大，使用泊松分布来估计二项式分布是一种更为简便的方法。根据泊松分布，可使用下式计算概率：P(X=k)=(np)ke-np/k!(2)P(X=k)5%为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳性标本在查清原因后重做。根据泊松分布的概率计算一个实验室中，某项目每次检测结果的阳性率约为2%，则在100个样本中出现8个阳性结果的概率。根据泊松分布，可使用公式（2）计算概率，此时n=100,p=0.02,k=8,np=2代入公式（2）计算得P(X=10)=28e-2/8!=0.0009。标本间交叉污染的概率计算如果所有阳性结果的出现是连续性的，则可能存在标本间的交叉污染，即阳性样本污染了它邻近的阴性样本，这种情况的概率计算公式如下：P=(n-r+1)/[n!/r!(n-r)!]（3）其中n为当次实验检测标本数，r为连续出现阳性的个数。当某次实际测定标本连续阳性的概率大于所计算的概率，则判为失控。阴性标本结果可以发出，阳性标本要考虑标本间交叉污染的问题。标本间交叉污染的概率计算如在一次检测100个标本的HBsAgELISA检测中，所有两个阳性结果连续出现的概率为：P=(100-2+1)/[100!/2!(100-2)!]=99/4950=0.02概率为2.0%。因此，如在100个标本中，连续出现两个为阳性次数有3次，即概率为3.0%，则为失控。而在一次检测100个标本，所有三个阳性结果连续出现的概率为：P=(100-3+1)/[100!/3!(100-3)!]=98/161700=0.0006概率为0.06%。因此，如果如在100个标本中，连续出现三个为阳性次数有1次，即概率为1.0%，为失控。室内质量控制的评价IQC是一个集体活动，不光是对实验室一次测定的有效性的判断，也反应了实验室测定趋势的变化。IQC的失控不能做为处罚的依据，应建设性的找出失控的原因，针对其采取措施加以改进。对IQC应定期进行评价。分析用质控（图）控制用质控（图）问题实例失控处理的20字原则查出异因采取措施保证消除不再出现纳入标准预防！防止同样的问题出现第二次是质量管理的“精髓”！我国雾霾的最主要原因：工厂、汽车尾气、烧烤、工地扬尘…..全面质量管理的工作循环:PDCA4个阶段，8个步骤第一阶段（Plan）有4个步骤：分析并找出问题；找出问题产生的原因；确定最主要原因；制定措施计划。第二阶段（Do）有1个步骤：执行计划第三阶段（Check）有1个步骤：检查计划执行情况。第四阶段（Action）有2个步骤：总结、制定标准（修改质量文件），以巩固提高；发现新出现的问题，转入下一PDCA循环。47PDCA的特点小环合成大环不断循环，阶梯式上升“A”是改进的动力之源48PDCAPDCAPlan•问题：质控品结果偏低•原因：质控品分装后体积不够（300μl、质控品不稳定？•措施：加大质控品分装量至400μl。Do•按照新的室内质控SOP执行Check•是否有同样的失控发生？•是否执行了新SOP？Action•总结，并将质控品的分装要求写进室内质控SOP。•是否出现新的问题？甲胎蛋白（AFP）质控失控发现质控结果超出均值−3SD）FAME-1（吐板数=299,总板数=5692（2号）单元锁定6%酶标仪锁定5%注液针堵塞19%废液管道堵塞2%分配单元丢步4%模块冲撞1%试剂量不足2%系统崩溃7%主传输架故障2%酶标仪读值异常11%孵育超限34%洗板头感应故障7%0.00%0.50%1.00%1.50%2.00%2.50%3.00%3.50%HBsAgR1HBsAgR2抗-HCVR1抗-HCVR2抗-HIVR1抗-HIVR2抗-TP49/156926/158927/159731/160028/157816/156022/1574ELISA各项目总失控率比较（08.03-12）ELISA失控原因分类（2008.3-12）环境温度影响10.26%对照品超出范围16.67%花板7.05%加样后进板前等待时间过长26.28%仪器故障23.72%试剂平衡时间不足1.28%8X偏向一侧10.90%试剂质量问题2.56%质控品位置错误1.28%IQC的局限性IQC可能测不出的误差测定前测定中测定后样本鉴定不对样本吸取不对结果记录错误样本贮存中变质试剂加入不对此类误差的发生率在不同的实验室有所不同，一般要求小于0.1%，且应均衡地分布于测定前、测定中和测定后的不同阶段。