第三章 发酵工业培养基设计

第三章发酵工业培养基设计1、单位培养基能产生最大量的目的产物2、能使目的产物的合成速率最大3、副产物合成的量最少4、质量稳定、价格低廉、易于长期获得5、尽量不影响后处理发酵工业培养基的要求P41本章内容§1培养基的类型及功能§2培养基的设计及优化§1培养基的类型及功能培养基的类型和用途发酵培养基的成分及来源一、培养基的类型和用途1.根据来源分：2.根据主要成分或使用目的分：3.根据用途分：天然培养基合成培养基半合成培养基基础培养基加富培养基鉴别培养基选择培养基孢子培养基——供制备孢子用；种子培养基——满足菌种生长；发酵培养基——满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累营养不能太丰富，尤其是有机氮源；无机盐浓度要适量，否则会影响孢子量和孢子颜色；注意pH和湿度营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素含量也要高一些除含有菌体生长所必须的营养物外，还要有产物所需的特定元素、前体物质和促进剂等生理代谢菌种筛选种子培养发酵培养谷氨酸发酵种子培养基和发酵培养基配方培养基成分种子培养基发酵培养基淀粉水解糖(%)2.512.5玉米浆(%2.5-3.50.5-0.8K2HPO4(%)0.150.15MgSO4(%)0.040.06尿素0.43Fe2+,Mn2+各2ppm各2ppm不同的发酵产物，不同的菌种所选择的发酵培养基是不同的。白酒(chinesespirit)发酵：固体发酵培养基；果酒(fruitspirit)发酵：果汁；啤酒(beer)发酵：麦芽汁液体培养基；酒精(alcohol)发酵：淀粉糖化醪；氨基酸(aminoacid)发酵：水解糖液加其他营养成分；柠檬酸(citricacid)发酵：淀粉液化醪；乳酸(lacticacid)发酵：淀粉糖化醪；甲烷(methane)发酵：复杂的有机废物发酵；抗生素(antibiotic)发酵：淀粉糖化醪+豆饼粉+麸皮粉※二、发酵培养基的成分及来源P42碳源氮源无机盐和微量元素水生长调节物质(一)、碳源碳源功能：为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分为合成目的产物提供所需的碳成分碳源来源葡萄糖纯葡萄糖，水解淀粉乳糖纯乳糖，乳清粉淀粉大麦，花生粉，燕麦粉，黑麦粉，大豆粉等蔗糖甜菜糖蜜，甘蔗糖蜜，粗红糖，精白糖等在微生物发酵过程中，普遍以碳水化合物作为碳源。生产疫苗时通常用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白质作为碳源。酒精、简单的有机酸、烷烃等含碳物质也可作为碳源。甲醇作为底物生产单细胞蛋白（SCP）用烷烃进行有机酸、维生素等的生产葡萄糖：最容易利用，但过多会加快呼吸，导致溶氧不足、pH下降，抑制生长与产物合成糖蜜：含糖（蔗糖）、氮类化合物、无机盐、维生素等，常用于丙酮丁醇生产淀粉糊精：需经胞外酶水解后才能利用，可克服葡萄糖代谢过快的弊端，价格低廉，常用玉米淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响2、油和脂肪油、脂肪甘油＋脂肪酸CO2＋H2OATP脂肪酶氧气※供氧要充足，否则会使有机酸积累，引起pH下降常用豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油3、有机酸会使pH上升CH3COONa＋O2→CO2+H2O+NaOH常用：乳酸、柠檬酸、乙酸4、烃和醇类正烷烃（C14～18)、乙醇(二)、氮源功能：构成菌体细胞物质和含氮代谢物氮源种类1、有机氮源种类：花生饼粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体、酒糟等※特点：菌体生长旺盛、菌丝浓度增长迅速2、无机氮源种类：铵盐、硝酸盐、氨水等可引起pH变化功能：生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物(三)、无机盐及微量元素1.磷酸盐2.硫酸镁3.钾盐4.微量元素磷是某些蛋白质和核酸的组成成分。磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。工业上常用K3PO4•3H2O、K3PO4和Na2HPO4•12H2O、NaH2PO4•2H2O等磷酸盐，也可用磷酸。①除了组成某些细胞的叶绿素成分外，并不参与任何细胞物质的合成；②处于离子状态时，是许多重要的酶（己糖磷酸化酶，柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂；③不但影响基质的氧化，还影响蛋白质的合成①钾离子与细胞渗透压和透性有关；②是许多酶的激活剂；③促进糖代谢①Zn、Co、Mn、Cu等元素大部分作为酶的辅基和激活剂；②一般作为碳、氮源的农副产品天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另加；③特例：VB12的生产，由于钴是其组成成分，Co的需要量随产物的增加而增加，因此在培养基中需加入氯化钴以补充钴（四）、水发酵工厂要求恒定水源（五）、生长调节物质1、生长因子广义说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子(又称生长素)，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等；狭义说，生长素仅指维生素。如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子。又如目前所使用的赖氨酸产生菌几乎都是谷氨酸产生菌的各种突变株，均为生物素缺陷型，同时也是某些氨基酸如高丝氨酸的缺陷型，需要生物素和某些氨基酸作为生长因子。不是所有微生物都必需的，只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物质。提供生长因子的农副产品原料1）玉米浆（cornsteepliquor,CSL）◇用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩液，也是玉米淀粉生产的副产品◇虽然主要用作氮源，但它含有丰富的氨基酸、核酸、维生素、无机盐等，常用作为提供生长因子的物质。2）麸皮水解液可代替玉米浆，蛋白质、氨基酸等营养成分比玉米浆少。用量一般为1%（以干麸皮计）左右水解条件：以干麸皮：水：HCl=4.6:26:1配比混合，装入水解锅中以0.07～0.08MPa表压加热水解70～80min。以干麸皮：水=1：20，用盐酸调pH值1.0，以0.25MPa表压加热水解20min。然后过滤取滤液。3）糖蜜（molasses）◇甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜均可代替玉米浆，但氨基酸等有机氮含量较低◇甘蔗糖蜜用量为0.1%～0.4%4)酵母酵母膏、酵母浸出液、酵母粉5）其他牛肉膏、蛋白胨、动物心、肝等组织浸液等都含有丰富的生长因子2、前体P47※是指加到发酵培养基中的某些化合物，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因其加入而有较大的提高。发现：最早是从青霉素的生产中被发现的。加入玉米浆后，青霉素单位可从20U/ml增加到100U/ml；玉米浆中含有苯乙胺，它能被优先合成到青霉素分子中，从而提高青霉素G的产量。发酵过程中所用的一些前体物质产物前体产物前体青霉素G青霉素V金霉素灰黄霉素红霉素苯乙酸及其衍生物苯氧乙酸氯化物氯化物正丙醇核黄素类胡萝卜素L-异亮氨酸L-色氨酸L－丝氨酸丙酸盐β－紫罗酮α－氨基丁酸邻氨基苯甲酸甘氨酸3、产物合成促进剂促进剂：细胞生长非必需，但加入后却能提高产量的添加剂,称为促进剂。常用促进剂表面活性剂——洗净剂（脂肪酰胺磺酸钠）、吐温80（聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯）、植酸等二乙胺四乙酸（EDTA）大豆油抽提物黄血盐（三水亚铁氰化钾，K4[Fe(CN)6].3H2O）甲醇促进剂能促进产量增加的原因：主要是改进了细胞的渗透性，增强了氧的传递速度，改善了菌体对氧的有效利用。（1）在酶制剂发酵过程中，加入某些诱导物、表面活性剂及其他一些产酶促进剂，可以大大增加菌体的产酶量。（2）抗生素工业在发酵过程中加入某些促进剂或抑制剂，常可促进抗生素的生物合成。抗生素的抑制剂抗生素被抑制的产物抑制剂链霉素甘露糖链霉素甘露聚糖去甲基链霉素链霉素乙硫氨酸四环素金霉素溴化物、巯基苯并噻唑、硫脲嘧啶、硫脲去甲基金霉素金霉素磺胺化合物、乙硫氨酸头孢菌素C头孢菌素NL-蛋氨酸利福霉素B其他利福霉素巴比妥药物（2）抗生素工业在发酵过程中加入某些促进剂或抑制剂，常可促进抗生素的生物合成。如：巴比妥能够增加链霉素产生菌的抗自溶能力，达到推迟菌体自溶的目的。聚乙烯醇可以改变发酵液的物理条件，达到改善通气效果、增加细胞渗透性的目的。酵母厌氧发酵中加入亚硫酸盐或碱类，可以促进酒精发酵转入甘油发酵。上节知识回顾培养基的分类：孢子培养基、种子培养基、发酵培养基培养基的组成：前体§2培养基的设计原理及优化方法培养基成分选择的原则培养基的优化培养基设计时应注意的问题一、培养基成分选择的原则1、做好调查研究工作2、对生产菌种要了解3、做好预实验4、先作单因子试验，后作多因子试验5、注意中间补料控制6、根据生产和科学研究的需要选择培养基7、根据经济效益选择培养基原料（一）、培养基确定方法※（二）、培养基成分选择的原则P491、菌体的同化能力即一些微生物由于不能分泌一些水解酶而无法利用某些大分子物质，而只能利用小分子物质。尤其碳源、氮源选择时要注意。以酿酒酵母为例：一般不含淀粉酶，不能利用（不）可溶性淀粉；细胞内缺乏将硝酸根离子还原为铵离子的所需催化酶，所以做培养基优化时，我们用氮源时考虑各种氨盐等而少考虑各种硝酸盐类。2、代谢的阻遏和诱导碳氮源要注意速效和迟效的相互搭配。（1）C源葡萄糖：分解代谢物会组遏或抑制某些产物合成所需的酶系的形成或酶的活性诱导酶制剂生产：易利用的碳源（葡萄糖、果糖）不利于产酶；难利用碳源（淀粉、糊精）对产酶有利。（2）N源微生物利用N源的能力随菌种、菌龄而已。多数能分泌胞外蛋白酶的菌株在有机氮源上可良好生长。同一微生物处于不同生长阶段对氮源的利用能力不同。生长早期易利用铵盐、氨基氮；生长中期利用蛋白质的能力强。蛋白酶生产受蛋白质或多肽的诱导；铵盐、硝酸盐的阻遏。3、合适的C、N比（1）N源：过多，菌体生长旺盛，pH偏高，不利于代谢物积累过少，菌体繁殖量少，影响产量（2）C源：过多，易造成较低的pH过少，易引起菌体的衰老和自溶一般工业发酵培养基的C/N＝100（0.2～2.0）谷氨酸发酵C/N＝100（15～21）4、合适的pH利用营养物质后，酸碱物质积累或代谢酸碱物质的形成会造成培养体系pH变化配制培养基时要充分考虑基本思路初步确定培养基组分通过单因子实验确定培养基组分及适宜的浓度通过多因子实验进一步确定培养基组分及适宜的浓度，选择最佳方案二、培养基的优化培养基成分的含量最终都是通过实验获得的合理的实验方法多因子实验：均匀设计、正交实验设计、响应面分析等。二、培养基的优化类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化郭秒,食品与工业发酵，2004类胡萝卜素的作用：色素、营养保健原培养基:初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源进一步：乙酸钠的浓度2%比较好结果：碳源：乙酸钠0.2%氮源：氯化铵0.2%酵母膏0.03%无机盐:复合无机盐0.05%正交设计确定优化的配方改进后培养基原培养基改进后培养基的发酵结果※正交试验设计(Orthogonalexperimentaldesign)均匀分散，齐整可比是一种高效率、快速、经济的实验设计方法日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选择的水平组合列成表格，称为正交表SNLq1、正交表的记号及含义正交表的列数（最多能安排的因素个数，包括交互作用、误差等）S正交表的行数（需要做的试验次数）N各因素的水平数（各因素的水平数相等）q正交表的代号L如782L表示782L表示各因素的水平数为2，做8次试验，最多考虑7个因素（含交互作用）的正交表。正交表的特点1、正交表中任意一列中，不同的数字出现的次数相等；表示：在试验安排中，所挑选出来的水平组合是均匀分布的（每个因素的各水平出现的次数相同）——均衡分散性2、正交表中任意两列，把同行的两个数字看成有序数对时，所有可能的数对出现的次数相同。表示：任意两因素的各种水平的搭配在所选试验中出现的次数相等——整齐可比性以上是设计正交试验表的基本准则2、正交实验的表头设计表头设计是正交设