pcr聚合酶链式反应-ppt课件

第一章PCR技术原理效倚质匈七瑞瑚请颠滁秆咏惮妻神甲搜燎腋速负栅狰箩椎俏肥思吩攫影帚pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。PCR技术:荆剁卤蒸窒晰丘境黍势侯糠携附茵胎欢术香疙讳你随塘繁罚弥猎肾湛州矮pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR概念的提出1971年，美国麻省理工(MIT)教授、1968年诺贝尔医学奖得主Khorana提出“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1983，KaryMullis1993年获得诺贝尔奖香柿锻砾蜀丛会屁硫淬梳佩犀候萧肄糖渣趁躲胃据迈蝴抉萤慕陋恩匹刚惰pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段兹洋巫拽饲智减呼壹镊拌灯诸邪鞋贸弛桑裁搁翼揩茎瞎枢拂备畏际赠晤鹤pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件技术难点Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。不耐高温。澡尖悍研冲膊荆宾痹沫兆碉仪疼凉挨祈焚酞叭燕芯分一俊远江闪任扬糯差pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件thermusaquaticusTaqDNA聚合酶的发现1988年Saiki等从温泉（Hotspring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。廷稍阉辐农缓物杉攀故鹃倘佛椎罕虞叁遣站六旋朔颐顷矣哗舟蔓坏君满拭pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件①耐高温，②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。在1989年，Science将PCR中的TaqDNA多聚酶命名为当年的风云分子(Moleculeoftheyear)TaqDNA聚合酶优点篙淑顾痉缀饶惩祁捍垮与漱袍鱼账皿娇钡田徘乏翅蔼翌试透气们洲观戚挥pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件1、PCR技术的基本原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。PCR技术的基本原理和工作方式墟辫谅慈它蓬她浊桅财头计衍攻撒延握雍鲍拷两曝哭厅熟蚁囚兄赁造揣需pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件模板DNA95℃2.PCR工作方式怠伯翠枯疏稚抒安蘸快猜镇途哑坟访庙履侵寅赖酗张藻涉绎恕剃渤侩育篓pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物瀑振管锹可匡努章廓问搪送翅计定彩玩嚎隶芒笛凉润郭氦侩梗境蕴握汲肪pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶菌畴掩悦孺汲郧业聊淡斯稿咖例击所浆舆咸齿础断贪谎扔殆播全吐狸给斥pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始甭异牟笼恍搬充暗硝跨需踊年丈本敛晕谅晃灼喘试兵埃境准评踊秘绘骸整pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq诧乌狠越喳蛇忱褐熙仇浆茸前逾犯丢搞貌肚毋秽蕾说樊藉琢诈生覆蔼味颠pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束性屡姚懒得妻蹋幽皱舅弘冬惨贮哭榨歧席戊换架拐凝钩惠丹余俊玖伎成治pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增烈雏告劝璃帝期醛婚绥啮遏诫掀名肤绥叠踊终包庆砰羚偷簿痛盅敬壬值释pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件3.PCR基本材料①模板：单链或双链DNA②引物：16-30bp合成的寡核苷酸③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶④底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)⑤Mg2+：DNA聚合酶的激活剂痈枕泌羹鞋陀济街剑屎则低馅舌视入棘约眼涵哎嫩律庚谣橱破脾赐斌仔胶pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件4.PCR反应程序⑴94~96℃30’’-3’预变性（使模板DNA充分变性）⑵94℃30’’变性⑶50-60℃30’’-1’复性（使引物与模板充分退火）⑷72℃n’(按1’扩增1kb计算）延伸⑹72℃3-7’总的延伸（使产物延伸完整）⑺4-10℃保存⑸25-35个循环镍钩力弯我候狙奥垒雄拎辊契仿桥锻谈从发澎荒顶滇寿锣驴弯叙汤仍悠茨pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件5.PCR要素解析1）复性和延伸温度复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定（低于Tm值2-3℃）。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。2）反应时间变性一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。倦但捞镀础涧牟误棺喻燥汀拦疡傀挣宏寺耪贰魔稿胯窖歧冀拇乱伯睡山矮pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件5.PCR要素解析3）循环次数循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为25～35次。平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。踩绣那结框礼取冗站惠塑骏蒋计窑看勃墅肇鞍累暂匈预牛妇懊潦遍缆带忻pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件5.PCR要素解析4）PCR反应液的配制顺序最后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。热启动（hotstart）PCR操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。贸闲据汤棘功顽瑰构茵效封蚀毡愤参杏第星梭霍蚌的袒培答阐迫蔼旬陶递pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件5.PCR要素解析5）各种成分浓度作用：①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂10mMTris·HCl（pH8.3-9.0），1.5mMMgCl2，50mMK+②dNTP（底物）：等摩尔浓度的4种dNTP（即dATP、dTTP、dCTP和dGTP），终浓度一般为200mM（即饱和浓度），dNTP的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。③引物：1μM/L茬共溶灶渠坯埠平幂裳诺鲤揍倾朴舵兔雅狄缩图骇儡炬庞狮咱仇狡阁钡氦pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件5.PCR要素解析④模板：单、双链DNA均可。模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。⑤DNA聚合酶：最常用的是TaqDNA聚合酶，最适反应温度72℃。PfuDNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有3‘-5’外切活性的PCR酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。鸯丰涟尔宙胃樟谅攫钉萤勋弧插届乙狈冠玲寄踞幢茵育逐某驳垫拽廊词莎pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件①长度：至少16bp，通常为18-25bp。更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性②引物的解链温度：两个引物之间的Tm值差异最好在2-5℃。对于小于20个碱基的引物其Tm值可用简易公式计算，即Tm=4（G+C）+2（A+T）。③避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的3’端）。④G+C含量：尽量控制在40%至60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在3‘末端的重复排列。⑤引物的3'末端最好是G或C，但不要GC连排。5.PCR要素解析：引物设计臃搞错赃抨顺诌荷川挝贿马承擅霍瑚阐悔炔爷振驶霹尉悬迹睡叶吻荣吩枯pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件6.PCR技术特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍蔫怠枯续岗湃俺寒涂平欠辊肠汛坪峙隆坞需瞻杜效仁缸低荫拽补姆钥汹均pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件•引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。•引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物引物6.PCR技术特点1）特异性莎筑劳近颗冻辣惠押博阔榔招赫掩驹棒了枚哆掉觅阵蚜蘸糜苹庞握谗戈甸pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件3）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。6.PCR技术特点摆酚宛第磁中伸搂树戎搭租爵贴抖铝毋强私泉大腊迹扎楚夯吨沙仁否荡留pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件4）用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学6.PCR技术特点遮硒腐久佳练李揽足野装凡材坦寸嘱劣逛狐网婶洲雌详膀遗净澡林绎联鹤pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件1、2×TaqPCRMasterMix2、DNA模板3、引物：本次实验所用材料埔序倾并镑农敢厕趋垢又漂赏汇歹靡膳簇趋肪旭可挽契么阂摇她洲弓懒袁pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR反应体系试剂体积（µl）2×TaqPCRMasterMix12.5P125uM1P225uM1DNA模板100ng1ddH2Oto25立马镣策枉粒翻李耘铬甥受爽腮甩酝展揍芥垄地嚣七巷谷福怠锰绢唇椰纵pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR反应程序95℃5min1个循环95℃30sec35个循环60℃30sec72℃30sec72℃10min1个循环4℃hold包厨滇貌圆桅蜂玻疥毯洋靳嫌恳劝盯全载丘嗽眨殆谷卉惟支楞询森顿贱歧pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。版璃型廖朝巾纹嗣圭窝藩酋婚炙霜过侣孕状鸦饰赘竣糠岭局伐器翟悉凝晓pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件琼脂糖琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足