第四章(质粒载体)

第四章质粒载体•第一节质粒载体概况•第二节质粒DNA的复制与拷贝数的控制•第三节质粒载体的构建•第四节重要的质粒载体•第五节质粒载体的稳定性问题第一节质粒载体的概况•一质粒的定义、命名、分类、分布•二质粒的基本生物学特性•三质粒的分离与纯化一、质粒的定义、命名、分类、分布•定义：质粒是一类寄宿于细胞内，独立于染色体外的自我复制并稳定遗传的环状双链DNA分子。•命名：小写字母p代表质粒，两个大写字母代表发明者，后接实验编号，•分类：•分布：1）根据质粒的性状特征①F质粒：又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。②R质粒：通称抗药性因子。编码有一种或数种抗菌素抗性基因，Co1质粒：产生大肠杆菌素因子。编码有控制大肠杆菌素合成的基因质粒分类•2）根据质粒的传递性•3）根据质粒的拷贝数•4）根据质粒和细菌的关系•4.质粒分布、大小和数目二、质粒的基本特性•1.寄生性•2．质粒DNA构型•3．质粒DNA编码的表型•4．质粒DNA的转移•5．质粒DNA的迁移作用•6．质粒DNA的复制类型•7．质粒的不亲和性•8.其他特性质粒的基本生物学特性•1.寄生性•2．质粒DNA•(图4—1)大肠杆菌质粒分子的结构示意图质粒DNA分子具有三种构型•SC构型:共价闭合环形DNA(cccDNA)，•超螺旋的SC构型；•OC构型:开环DNA(ocDNA)，OC构型；•L构型:发生双链断裂而形成线性分子•(LDNA)，L构型。（图4－2）环形双链DNA质粒分子的三种构型质粒DNA的分子构型质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图(a)(b)OCSCL3.质粒DNA编码的表型•抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子，•质粒DNA编码的基因有产生抗菌素的基因、芳香族化合物降解基因、糖酵解基因、产生肠毒素基因、重金属抗性基因、产生细菌素的基因、诱发植物肿瘤基因、产生硫化氢基因，以及寄主控制的限制与修饰系统的基因等4．质粒DNA的转移•(1)接合型质粒的自我传递•(2)F质粒•(3)质粒DNA的接合转移•①细胞交配对的形成•②质粒DNA的转移细菌的接合作用•在合适的条件下，雄性细胞和雌性细胞混合培养，形成雌—雄细胞配对过程为细菌的接合作用(conjugation)。•在雌雄细胞配对期间，雄性细胞中的F因子按滚环复制模式(rollingcirclereplicationmodel)，(1)接合型质粒的自我传递•格兰氏阴性细菌的质粒分成接合型和非接合型。•接合型的质粒(conjugativeplasmid)，又叫自我转移的质粒。除了具有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。•非接合型的质粒(non—conjugativeplasmid)，不能自我转移是因为没有了控制细胞配对和接合转移的基因。(2)F质粒•又叫F因子(ferti1ityfactor)，单拷贝的接合型质粒，其分子量约为94kb，共编码19个转移基因(tra)。F质粒有三种存在方式：•(i)以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，不带有染色体的基因或DNA区段。这样的细胞叫做F+细胞。•(ii)以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时还携带着细菌的染色体基因或DNA区段。这样的细胞叫做F’细胞。•(iii)以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上，这样的细胞叫做Hfr细胞(高频重组细胞)。大肠杆菌F因子基因图(3)质粒DNA的接合转移机制•①细胞交配对的形成：大肠杆菌F质粒编码的特异性性须，在受体细胞的识别以及在确立配对细胞之间的表面接触中起着重要的作用。它至少需要25种以上的转移基因编码产物的参与。•②质粒DNA的转移F质粒DNA的转移是从转移起点oriT开始的。大肠杆菌F质粒转移区结构---该区编码着控制细胞接合作用的基因质粒DNA的接合转移及复制5．质粒DNA的迁移作用•共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用。F因子带动Co1E1质粒转移的条件6.质粒的复制类型•两种不同的复制型：•“严紧型”(stringentplasmid)；•“松驰型”(relaxedplasmid)。•质粒拷贝数的定义：•每个细菌细胞中所含有的质粒DNA•分子的数目7．质粒的不亲和性(1)质粒的不亲和性现象(2)质粒不亲和性的分子基础8.质粒的其他特性•稳定性：维持一定的拷贝数•同源性：不同的质粒有相同的同源区•重组性：质粒间、质粒同染色体间重组•消除和恢复性等特性三.质粒DNA的分离与纯化•1．氯化铯密度梯度离心法•2．碱变性法•3．微量碱变性法•4．影响质粒DNA产量的因素•(1)寄主菌株的遗传背景•(2)质粒的拷贝数及分子大小1．氯化铯密度梯度离心法•2．碱变性法•3．微量碱变性法•4．影响质粒DNA产量的因素•(1)寄主菌株的遗传背景•(2)质粒的拷贝数及分子大小分离纯化质粒DNA的程序寄主菌株的遗传背景•使用endA基因发生突变的(endAl)大肠杆菌寄主菌株，•endA基因突变，使大肠杆菌寄主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力，增进了质粒DNA分子的稳定性。第二节质粒DNA的复制与拷贝数的控制•1．质粒DNA复制的多样性•2．ColEl质粒DNA复制的启动•3．质粒DNA拷贝数的控制•(1)天然质粒拷贝数的控制•(2)杂种质粒拷贝数的控制•4．质粒复制控制的分子模型•(1)抑制蛋白质稀释模型•(2)自体阻遏蛋白质模型质粒DNA的复制与拷贝数的控制•1．质粒DNA复制的多样性•(i)对寄主酶的依赖性•(ii)DNA聚合酶的利用•(iii)复制的方向性•(iv)复制的终止•(v)复制型•2．ColE1质粒DNA复制的启动•3．质粒DNA拷贝数的控制•(1)天然质粒拷贝数的控制•(2)杂种质粒拷贝数的控制Co1El、pSCl01及其杂种质粒pSCl34的DNA复制4．质粒复制控制的分子模型•(1)抑制蛋白质稀释模型•(2)自体阻遏蛋白质模型质粒DNA复制控制的抑制蛋白质稀释模型质粒DNA复制控制的自体阻遏蛋白质模型第三节质粒载体的构建•1．天然质粒用作克隆载体的局限性•2．质粒载体必须具备的基本条件•3．质粒载体的选择记号•4．不同类型的质粒载体•(1)高拷贝数的质粒载体•(2)低拷贝数的质粒载体•(3)失控的质粒载体•(4)插入失活型的质粒载体•(5)正选择的质粒载体•(6)表达型的质粒载体1．天然质粒用作克隆载体的局限性•天然质粒有Co1E1、RSF2124和PSCl01等。天然质粒的局限性：如质粒的分子量较大，拷贝数较低，只有一个抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选择重组体分子等。2．质粒载体必须具备的基本条件•(i)具有复制起点•(ii)具有可选择的标记•(iii)具有若干限制酶单一识别位点•(iv)具有较小的分子量和较高的拷贝数•(v)作为表达载体还有启动子，转录转移信号，终止子序列等片段。3．质粒载体的选择记号•在基因克隆中采用的质粒载体的选择记号，有新陈代谢特性、对大肠杆菌素E1的免疫性，抗菌素抗性等。使用抗菌素抗性记号有四环素抗性、氨苄青霉素抗性、链霉素抗性，卡那霉素抗性等正选择质粒载体PKN80的形体图4．不同类型的质粒载体•(1)高拷贝数的质粒载体•(2)低拷贝数的质粒载体•(3)失控的质粒载体•(4)插入失活型的质粒载体•(5)正选择的质粒载体•(6)表达型的质粒载体•复制基因(replicator)•选择性记号•克隆位点•基因克隆质粒载体的三种组成二、构建载体的一般程序•1.根据原则设计•2.分离纯化DNA片段•3.DNA片段连接重组•4.重组连接液转化•5.筛选重组转化子•6.载体的有关DNA序列分析第四节重要的质粒载体•一.大肠杆菌质粒载体•1．pSCl01质粒载体••2．Co1E1质粒载体•3．pBR322质粒载体•4．pUC质粒载体•5．丧失迁移功能的质粒载体6.能在体外转录克隆基因的质粒载体一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体的形体图二、酵母菌质粒载体（穿梭质粒）•１．酵母2µ质粒•２．乳酸克鲁维酵母中的线性质粒•３．大肠杆菌－酵母穿梭质粒•４．酵母表达型质粒•５．酵母分泌型表达质粒•６．酵母人工染色体－YAC1．pSCl01质粒载体2．CoEEl质粒载体pSCl01质粒作载体克隆非洲爪赡的基因3．pBR322质粒载体•(1)pBR322质粒载体的构建•(2)pBR322质粒载体的优点•具有较小的分子量•具有两种抗菌素抗性基因可供作转•化子的选择记号。•具较高的拷贝数•(3)pBR322质粒载体的改良pBR322质粒载体的构建过程pBR322质粒载体的形体图pBR322质粒载体的结构来源pBR322质粒载体tet基因的插入失活效应pBH20pBR322EcoRIEcoRIKlenowλHaeⅢHaeⅢEcoRIEcoRIplacHaeIIIHindIIIBamHIHhalacHindIIIEcoRIligationpBH20HindIIIBamHIHhalacHindIIIEcoRIEcoRIBamHISamastetinBamHIEcoRIligationpsomIHindIIIEcoRIBamHISamastetinHhalacPstIlacpsomIHindIIIEcoRIBamHISamastetinHhaPstIpBR322PstIEcoRIAmpEcoRIPstIEcoRIPstIpSomIIPstIEcoRIBamHIAmpSomastetinligationpSomIIEcoRIBamHIAmpSomastetinPstIEcoRIEcoRILac-β-gal-3EcoRIEcoRIligationpSomIIILac-β-galsomastetin4．pUC质粒载体•(1)pUC质粒载体的结构•(2)pUC质粒载体的优点•第一，具有更小的分子量和更高的拷贝数•第二，适用于组织化学方法检测重组体•第三，具有多克隆位点MCS区段pUCl8及PUCl9质粒载体的形体图丧失迁移功能的pBR327质粒载体的形体图5．其它重要的质粒载体••(1)丧失迁移功能的质粒载体•拥有较高水平的拷贝数•失去了bom位点，即便在共存的F质粒提供转移装置的条件下，也不可能发生迁移作用。•(2)能在体外转录克隆基因的质粒载体pSP64质粒载体的形体图pSP64与PSP65质粒载体的多克隆位点区的核苷酸序列结构(3)穿梭质粒载体•穿梭质粒载体(shuttleplasmidvector)，是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。•穿梭质粒载体，有大肠杆菌—枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体，大肠杆菌—酿酒酵母穿梭质粒载体。大肠杆菌—酿酒酵母穿梭质粒载体第六节质粒载体的稳定性问题•1．质粒载体不稳定性的类型•(1)结构的不稳定性•(2)分离的不稳定性•2．影响质粒载体稳定性的主要因素•(1)新陈代谢负荷•(2)拷贝数差度•(3)寄主重组体系•3．随机分配的分子机理•(1)控制环路使质粒拷贝数的限制在最低的水平•(2)位点特异的重组作用消除质粒的寡聚体•(3)调节细胞的分裂活动阻止无质粒细胞的产生•(4)大肠杆菌素的合成增进了质粒的稳定性•4．主动分配的分子机理•(1)分配区的结构与功能•(2)预配对模型•(3)二聚体的解离有助于质粒的主动分配•(4)寄主致死功能对质粒稳定性的效应1．质粒载体不稳定性的类型质粒的不稳定性(plasmidinstability)，包括分离的不稳定性(segrega—tionalinstability)和结构的不稳定性(structuralinstability)(1)结构的不稳定性DNA的缺失、插入和重排都是造成质粒载体结构不稳定性的原因。(2)分离的不稳定性在细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配，也是导致质粒不稳定性的重要原因。2．影响质粒载体稳定性的主要因素••(1)新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应•(2)拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响•(3)寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应在细胞分裂过程中质粒的分配方式3．随机分配的分子机理•