动物实验设计与实施

动物实验设计与实施南方医科大学实验动物中心第一部分：动物实验设计和实施的基本过程一、选择研究题目1、广义的选择2、狭义的选择3、政府法规需要正确选题应遵守的几个基本原则；1、科学性：是指选题应建立在前人的科学理论和实验基础上，而不是毫无根据的胡思乱想。2、目的性：指选题应具有明确的理论意义和实践意义，要能解决具体问题。3、创造性：指选题应具有自己独到之处，或提出新规律、新见解、新技术、新方法，或是对旧有的规律、技术、方法有所修改、补充。4、可行性：是指选题应切合研究者的学术水平、技术水平和实验条件，还要结合研究者的工作基础，使实验能够顺利实施。二、提出假说假说提出的一般过程：1、观察和记录所有相关的信息（包括研究者已开展的初步实验结果）2、分析和归类这些信息3、在这些信息的基础上提出假说•假说是预先假定的答案或解释，亦既是实验的预期结果。对于动物实验研究来说，假说是十分必要的。假说是实验研究设计的前提，如果没有假说，实验和观察就失去目标。假说关系着实验研究的目的性、计划性和预见性。•对假说既应努力加以验证，又应适时加以抛弃，重新建立新的假说，再加以验证。这样才有可能使正确的假说上升为结论、原理和学说。•研究者开展动物实验前，应在熟悉有关实验动物理论知识和动物实验技能的基础上，积极进行逻辑思维，结合实际条件，提出创新性课题和大胆的假说。三、选择研究材料主要是用于制作实验需要的动物模型1.常规品种（系）2.特殊品种（系）：疾病模型动物、转基因品系等3.高峰期4.特殊规格：F1、乳鼠等5.外购：外地、外国、非商业性单位等四、准备研究方案1、示意性的实验设计，包含了实验过程中的各种处理2、对实验操作过程的解说和测量方法的描述3、简述可能对动物造成的不适4、应用动物的例数和所用的统计学方法都应当加以说明5、简述实验准备情况，包括准备的方法、过程和分析的资料6、实验中的一些实际情况：人员需求、实验负责人姓名、所需经费实验方法的选定•实验方法按学科可分为生理学方法、生物化学方法、生物物理方法、免疫学方法等；•按性质可分为形态学方法、机能学方法•按范围可分为整体综合方法和局部分析方法•按水平分：整体水平、器官水平、细胞水平、亚细胞水平、分子水平和量子水平等。无论选用何种实验方法，均应保证以下几点:•可靠性：即切实可行，稳定可靠，是大家公认的方法，也即是经典方法。•优越性：指实验方法既具先进的一面，又便于与其它实验方法相互配合，故也称先进性和协同性。•创造性：即实验方法的创新和改良。例：外源基因转染的细胞体内移植研究测定方法：1.整体水平：测定体液的生理生化指标2.细胞和亚细胞水平：光镜和电镜观察3.RNA水平：•原位杂交法测定mRNA•RT-PCR法半定量测定RNA表达量•Northern法定量测定。4.蛋白水平：•免疫组化与生物体视学结合•Westernblotting定量测定•Elisa法测蛋白活性五、动物实验前的条件准备主要内容：准备好实验仪器、药品、试剂和实验动物。实验条件的准备要求是尽可能使实验手段和实验方法标准化。•实验仪器必须校准，必须事先熟悉仪器使用方法。a、还要和相关科室联系，达到部分仪器共享使用的目的。同时注意某些学科不太常用的仪器设备是否存在，是否会影响实验指标的检测；b、测定动物生理、生化、生物电和器官功能指标的各种分析仪器和描记仪，如半导体测温计、动物血压表、多导生理记录仪等设备。•药品的纯度应有明确要求，试剂的配制必须严格遵守操作规程，尤其是麻醉剂的使用。•器械准备、实验场所消毒与器具配套等也要落实，特殊器械是否准备：如显微外科或眼科手术器械。实验动物的准备1.购入或领取实验动物前，应进行各项计划的核实，检查各项实验前的准备工作，如动物笼盒数量、饲养室卫生及消毒情况。2.购入或领取实验动物时，应向供应部门索取所用动物的遗传背景和微生物控制质量资料、以及动物品系、年龄、体重、胎次等资料。3.根据实验观察时间长短的需要，同时购入或领取相应数量的饲料和垫料。4.若是从外地购入动物需长途运输时，还应考虑到途中各种因素对动物的影响，如运输环境的温度，湿度、饮食。尤其注意途中污染和窒息死亡以及应激反应等问题。应隔离检疫并提供3周左右的动物适应期。5.若是购入或领取清洁级以上实验动物，应采用带有空气过滤膜的无菌运输罐或带有滤帽的笼盒运输，严格检查其密封状况。6.术前准备：术前3天单笼饲养，术前8－24小时禁食、禁水。六、预实验是在动物实验前对正式实验进行初步实验。目的在于检查各项准备工作是否完善，实验方法和步骤是否切实可行，测试指标是否稳定可靠，初步了解实验结果与预期结果的距离，从而为正式实验提供补充、修正的意见和经验，是动物实验必不可少的重要环节。预实验可用少量动物进行，实验方法和观测指标应该和正式实验一样，但预实验的结果不能归入正式实验的最后结果中一同分析。预实验一样要得到伦理委员会的审批才可实施。七、实验的详尽方案和实施1、需要准备一个动物实验的日程表，写上简单明了的实验方案，实验过程应该描述清楚，注明对实验动物品种、品系的选择，动物的营养、饲喂方式和时间的选择，样本的采集和安乐死的方式。2、详细的草案还应该包括实验者、实验动物和实验技术等几个方面的问题。实验技术如给药途径和方法、术式、麻醉方法和深度、复苏和抢救措施等。3、实验结束时收集所有的实验资料，进行各种后续指标的检测，包括运用数学统计的方法分析处理实验数据。4、分析结果是否证明了原来的假设。八、评估和报告1、标题和实验者：包括所有参与实验研究的人员。2、摘要：简要介绍实验研究的目的、实验设计、实验方法和结论。3、导论：简单地介绍相关的背景知识、国内外类似研究现状，提出可能的假设。如果假设不成立的话陈述一下预期的结果。4、材料和方法：5、实验结果：通过图形、表格和文字等将实验结果展示出来，文字要简介扼要。6、实验结论：简单扼要的得出实验结论，说明假设被证明的情况和取得的科研成果，为将来的研究提出好的建议。7、致谢8、参考文献第二部分：动物实验组织和管理概论使用实验动物进行生物医学研究计划不是一个人能够实施的，是一个涉及很多人、复杂的研究过程。动物实验研究需要各种人员进行适当的分工、配合。•研究人员设计、组织和实施动物实验和经费管理，撰写研究报告；•有动物实验资格的技术员按照实验设计进行具体的实验操作；•动物饲养员日常饲喂、管理；•实验动物管理委员会检查实验中动物的福利是否得到保障、实验方法是否人道等。一、关于动物实验的法律、法规和相关要求1、动物实验方案是否符合国家法律？在很多国家，不是所有关于动物实验的方案都可以实施。2、所利用的动物实验研究机构是否是政府部门认可的有权进行动物实验的机构。3、研究人员进行动物实验设计和实施的资格。4、是否有充分的理由解释使用动物进行研究的必要性。5、是否有足够的专业人员（饲养员、技术员等）来保证实验顺利进行。6、实验动物的来源是否合法，是否符合实验动物的各种标准化控制条件。7、是否与当地的动物福利机构有了沟通。8、研究计划的进行是否得到实验管理委员会的批准。9、是否有完整的实验记录。实验动物管理委员会（IACUC）实验动物福利和伦理管理委员会二、动物实验的影响因素的控制要尽可能满足下列条件，使实验和动物的变异降到最小。一、动物因素种属、品种、品系、年龄、体重及性别、生理状态、健康状况二、环境因素温、湿度、气流、洁净度、光照、噪声、营养、饲喂、环境微生物三、技术因素实验季节、昼夜过程、麻醉深度、手术技巧、用药途径和方法等三、相关规范、规程和认证优良实验室操作规范GLP（GoodLaboratoryPractice,GLP)是国际上通用的具有良好的质量管理规范的简称，是药品安全性评价过程中就组织管理、项目实施、记录报告、资料保存等方面所制定的法规，其目的在于保证药品安全性评价的完整性、可靠性和重复性。尽管GLP最初目标是为了保证动物实验在药物毒性研究中的准确性，将GLP规则推广到其它涉及动物实验的研究领域中，有利于这些研究项目的标准化，增加实验结果的重复性。当然，GLP规则并不能适合所有的动物实验研究，因为每一类型的动物实验对于标准化都有其自身特殊的意义。药物安全性评价实验包括：单次给药毒性试验、反复给药毒性试验、生殖毒性试验、遗传毒性试验、致癌试验、局部毒性试验、免疫原性试验、安全性药理试验、依赖性试验、毒代动学试验等。标准操作规程SOP（StandardOperatingProcedure,SOP）:为有效地实施和完成某一试验研究中每项工作所拟定的标准和详细的书面规程。针对动物实验研究主要的SOP规范有：对动物饲养、卫生、实验技术、观测方法、动物检查、数据收集和处理等都要有标准的SOP操作规程。1.动物分组与识别的SOP、2.饲养管理SOP、3.观察记录及实验操作的SOP、4.动物尸检以及组织病理学检查处理的SOP、5.动物尸体及其他废弃物处理的SOP、6.实验标本的采集、7.编号和检验的SOP、8.数据统计处理的SOP、9.资料档案管理SOP等AAALAC认证实验动物管理评估和认证协会（AssociationforAssessmentandAccreditationofLaboratoryAnimalCare,AAALAC）:非赢利的私人组织，权威的评估和认证动物饲养和使用标准的国际机构，它要求人道、科学地对待动物。FDA和欧盟强力推荐在有AAALAC认证的实验室开展的动物实验。世界500强医药巨头联合申明，他们医药产品的动物实验都将在AAALAC认证单位完成。AAALAC认证在世界范围内享有很高的声誉，为实验动物领域树立了高标准的楷模。（目前世界上已有29个国家的770多个机构通过了AAALAC认证。中国有12个机构通过了AAALAC认证，广东地区广州医工院通过Beagle犬认证）广西食蟹猴实验动物研发基地广西：南宁国家高新区投资建成了“广西南宁国际灵长类动物模型与医药产业化示范基地”，是国内第一家通过国际资质认证的灵长类实验动物室四、动物实验集中化•实验动物供应室：进行实验动物生产、采购、饲养、检疫。•实验动物旅馆：除了第一类服务范围外，还可以安置、喂养不常用动物或需要特殊安置的动物。如羊、犬、灵长类等。但是如果进行外科手术、X射线、胃镜等检测时还需要更换地方进行相关项目检查。•动物实验中心；是动物实验集中化的最高形式，基本可以满足一站式服务。我校的动物实验设施南方医科大学东莞松山湖实验动物科技园东莞松山湖科技产业园区DongguanSongshanLakeSci.Lake五、实验的时间安排1、必须留出足够的时间购买动物。2、必须留出必要的检疫期。3、充分估计到动物不可预料的死亡或是自然死亡可能给实验带来的影响。4、必须留出足够的时间来学习和掌握新的技术。5、必须留出足够的时间来准备特殊的动物饲料。6、进行必要的预实验。7、得到管理部门的许可。8、落实动物实验所需的后勤资源保障：如动物房、饲养人员、实验操作技术人员、试剂购买、所需配备的特殊设备（层流架、隔离器等）六、与他人协作•研究组人员要保持沟通，及时总结经验，对下一步工作进行预计。出现问题后商量如何调整实验进程等等。•要保证有一个和谐的研究团体，强调各个环节的协作性。西藏小型猪器官移植和转基因克隆研究七、动物实验的安全性1、正视实验动物饲养和实验环境对动物的影响，严格控制各种影响实验结果的动物疾病，尤其是动物传染病，如小鼠仙台病毒、兔脑炎病毒等。2、严格控制各类人兽共患病的发生，尤其是使用野生动物（如灵长类动物）时，由于高等级动物和人类的亲缘性更近，其疾病的易感性更强，要特别注意安全保护。如出血热、狂犬病、传染性肝炎、猴疱疹病毒、布鲁氏菌病等。3、感染动物实验：专门的感染动物实验设施，如P3实验室（生物安全防护3级实验室）。实验动物病原分类A:人畜共患病B:实验动物致死病原C:非致死但可引起实验动物发生疾病或生理功能改变D:条件致病菌E:非病原但可为反映实验动物微生物控制的指标等級微生物種類小鼠大鼠A漢他病毒（Hantavirus）○淋巴球性膜絡腦膜腦