胰岛分离与纯化技术手册

前言胰岛移植中，保证胰岛供体的数量和质量是胰岛移植成功的关键；从事糖尿病研究的实验也常常需要胰岛细胞。因此，早在20世纪60年代就已经开始了小动物胰岛分离方法的探索，Hellerstrom等曾直接从有高血糖的肥胖小鼠分离胰岛用于检测酶活性，后来用同样的方法分离正常小鼠、大鼠和豚鼠的胰岛。由于胰岛散在分布于胰腺的外分泌组织中，并与周围组织紧密连接，胰岛的分离过程实际上是将其从富含消化酶的腺泡中分离出来。所以无论使用何种方法，都会不可避免地引起胰腺外分泌部的破坏、释放的多种酶影响胰岛的数量和质量。因此，胰岛分离是组织细胞分离中最困难的，而提取胰岛的方法存在缺欠、胰腺缺血时间过长、损伤和胰岛的纯化方法等，都是影响胰岛得率的重要因素。其中消化胰腺提取胰岛的过程被认为是至关重要的步骤。不仅各种动物的胰岛分离方法不同，同一动物胚胎与成年的分离方法也不同，稍有偏差就可能导致“颗粒无收”。dongwp1写在前面的感谢经过近两个月的工作，这本电子书终于可以和大家见面了。电子书的完成离不开原帖中战友的精彩发言，特别是dongwp战友的多次精彩解答，也离不开大家的支持。感谢！电子书制作：libiecao战友封面制作：libiecao战友零余（非dxyer，友情赞助）电子书整理：小小东方电子书校对：dongwp战友图片提供：dongwp战友morgan1980战友abob_ren战友jinghuanlv战友yangjhdoctor战友clsun213战友knockout战友doctorshi战友lilianzhang战友AZAFIGHTING战友小小东方2目录一、大鼠、小鼠、胎鼠及成人胰岛分离纯化的基本步骤......4大鼠胰岛细胞分离与纯化（小鼠与大鼠同）..........................4胎小鼠胰岛分离..................................................7成人胰腺消化、胰岛分离方法......................................7人胎胰岛冷冻保存方法............................................8胰岛鉴定方法....................................................8胰岛功能检测....................................................9二、实例分析.........................................11dongwp战友的胰岛单层细胞照片...................................11morgan1980战友的胰岛分离照片...................................13yangjhdoctor战友的胰岛分离照片.................................16clsun213战友的胰岛分离照片及解说...............................19战友的胰岛分离照片及点评.......................................20knockout战友的胰岛分离照片及点评(1)............................21knockout战友的胰岛分离照片及点评(2)............................23knockout战友的胰岛分离照片及点评(3)............................26knockout战友的胰岛分离照片及点评(4)............................28knockout战友的胰岛分离照片及点评(5)............................31doctorshi战友的胰岛分离照片及点评（1）.........................32doctorshi战友的胰岛分离照片及点评（2）.........................36lilianzhang战友的胰岛分离照片及点评............................39AZAFIGHTING战友的胰岛分离照片..................................41三、Q&A.............................................42试剂的选择和配制...............................................42关于胶原酶..............................................................42DTZ的配置...............................................................43其他....................................................................44胰岛的分离纯化具体实施详解.....................................46胰腺的分离..............................................................46胰岛的分离和纯化........................................................48其他....................................................................54胰岛的分离纯化个例答疑.........................................55经验交流.......................................................623一、大鼠、小鼠、胎鼠及成人胰岛分离纯化的基本步骤大鼠胰岛细胞分离与纯化（小鼠与大鼠同）1.成年SD大鼠，8～10周龄，体重250～300g，10%戊巴比妥钠40mg/kg肌肉注射麻醉。2.固定四肢成仰卧位，酒精全身消毒，胸腹部备皮后常规碘酒、酒精消毒，腹部“个”切口，分层进入腹腔，牵开肠管，显露胰管及胆总管。3.1号丝线于胰管紧靠肠壁处结扎（图1-1），胆总管内插入4.5-5号头皮针，丝线结扎固定，切开胸腔，破心放血处死，经胆总管内插管逆行注入预冷的0.5mg/ml胶原酶p溶液8～10ml（视个体大小而定）（图1-2,1-3），使胰腺膨胀，迅速摘取整个胰腺，移入预置6mlHank’s液的消化瓶中。6mlHanks液起到水浴的作用，胶原酶在胰腺内消化，不会被稀释。但在振摇后起到稀释作用，使胰岛在振摇时的被进一步消化受到抑制。注意插管必须在紧贴12指肠处进针，因为有分支，如果进针靠前会使部分胰腺得不到灌注。插管后应该可以看到胆汁回流。图1-1结扎胰管dongwp战友提供4图1-2分离胰腺abob_ren战友提供图1-3刚灌注好的胰腺abob_ren战友提供54.38℃水浴中静止消化10分钟，取出置于冰浴中用眼科镊撕碎胰腺，（消化熟练后可免去此步，直接振摇。此步可了解消化的情况，很容易撕碎的表示已达到消化的要求）。移入消化瓶中振荡15秒使其呈细砂状，加入4℃小牛血清10ml与4℃Hank’s液30ml终止消化。振摇时应该用手腕的力用力振摇后呈细小颗粒（泥沙状）。5.用600μm不锈钢丝网过滤，细胞悬液用50ml离心管1000rpm4℃离心1-2分钟，弃去上清液，沉淀物加入4℃Hank’s液洗涤，同样方法离心洗涤，加冷Hank’s液重悬后均分到2根15ml离心管内，1000rpm4℃离心2分钟，弃去上清液。6.沉淀物加25%Ficoll4ml混匀，其上依次分别加入23%、20%、11%Ficoll溶液和Hank’s液各2ml，3000rpm，4℃离心20分钟，吸出23%～20%及20%～11%界面的胰岛，用4℃Hank’s液于50ml离心管内离心洗涤2次备用。胶原酶P配制：在D-Hank’s液中加入7.5mmol/LCaCl2、10mmol/LHEPES、0.2%酚红指示剂，用NaOH调PH值（7.8）后储存。临用时取上述配制好的溶液按0.5mg/ml加入胶原酶P，0.22um针头滤器过滤除菌后使用。Ficoll400配制：Ficoll配制：称取Ficoll100g，加250mlHanks液（不含CaCl2、NaHCO），待全部溶解后用上述Hank’s液定容到400ml，此为25%Ficoll；充分混匀后取92ml，加上述Hanks液定容到100ml，此为23%Ficoll；取80ml用上述Hanks液定容到100ml，此为20%Ficoll；取44ml用上述Hanks液定容到100ml，此为11%Ficoll。全部配制完成后高压或煮沸灭菌，4℃保存。1、Ficoll100g+Hank’s溶液200ml，完全溶解后加Hank’s至400ml即为25%Ficoll溶液。2、25%Ficoll92ml+Hank’s8ml即为23%Ficoll溶液。3、25%Ficoll80ml+Hank’s20ml即为20%Ficoll溶液。4、25%Ficoll44ml+Hank’s56ml即为11%Ficoll溶液。附：Hanks成份剂量表药物剂量(g)NaCl8.0KCl0.4MgSO4·7H2O0.1MgCl2·6H2O0.1Na2HPO4·2H2O0.06KH2PO4·2H2O0.06葡萄糖0.3蒸馏水1000mlCaCl21.85NaHCO30.35D-hank’s100ml液体里，加氯化钙7.5x110=825mg/L=82.5mg/100ml6配方：药物剂量(g)NaCL8.0gKCL0.4gNa2HPO4.12H2O0.06gKH2PO40.06gNaHCO30.35g葡萄糖0.55gHEPES2.38g溶于800ml双蒸水中。无水CaCl2--0.825g，溶于100ml双蒸水中。（酚红1%--4ml，加或不加都可以）1NNaOH调pH7.6定容至1000ml。PH值是7.8是参考文献的，在使用中不容易掌握，稍过就会产生沉淀，冻存更易发生。后降低到7.6，发现消化没明显差异，但不会发生沉淀的情况，所以建议用pH7.6。胎小鼠胰岛分离剪碎后加胶原酶（0.5mg/ml），37度振荡消化8分钟，弃上清，加胶原酶，37度振荡消化8分钟，吸出细胞悬液，在悬液中加血清和冷Hank’s液终止消化，沉淀加胶原酶继续37度振荡消化8分钟，与前次细胞悬液合并，加血清和冷Hanks液终止消化，1000rpm2分钟离心沉淀，Hanks液洗2次，37度培养。培养的为胰岛样细胞团（ICCs）。成人胰腺消化、胰岛分离方法成人胰岛分离（29、24、21、11%）是早年用于成人胰岛分离的方法，国外有很多文献报道，Roche的LiberaseHI的说明书也介绍用1.100、1.080、1.060、1.040分离成人胰岛，其所述的比重接近上述的百分比浓度，由于现在的成人胰岛分离已采用COBE2991细胞淘洗机，故大多用连续密度梯度分离。尸体胰腺原位灌洗后置UW液中，4℃保存运输。到实验室后在4℃Euro-Collins液中清除非胰组织，从胰管内插入穿刺针，丝线缝扎后用注射器灌注Liberase酶溶液（1.5mg/ml）。胰腺充分膨胀后将胰腺切片，置消化罐中并放入数颗玻璃珠，加500μm孔径的不锈钢丝网，旋紧罐盖。开启蠕动泵将剩余的Liberase酶溶液泵入罐内，控制罐内温度37℃，手动振摇消化罐循环消化，于10分钟后开始取样镜检，待大部分胰岛分离后用冷的含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养液降温稀释终止消化。收集消化物用10%FBS1640离心洗涤，将消化物混悬于150mlUW