实验用培养基适用性检查标准操作规程

起草人Preparedby:起草日期Date:_____________________QC审核人Reviewedby:审核日期Date:_____________________QC审核人Reviewedby:审核日期Date:QA批准人Approvedby:批准日期Date:质量部QD颁发部门IssuedbyQC执行日期EffectiveDate替换文件ReplacedForSOP-QC-562-02实验用培养基适用性检查标准操作规程复审日期ReviewDate分发部门：DistributedtoQA,QC分发号DistributionNo.:目的Purpose为保障微生物检验的准确性及相关工作特制定本规定。范围Scope本程序适用于微生物限度测定培养基的适用性检查及相关工作。职责Responsibility分析员：严格按照本操作规程执行。及时完成各类相关记录。在主管的指导下进行任何可能的OOS及偏差调查。主管：监督本操作规程的执行。对检验员进行必要的培训。指导任何可能的OOS和偏差调查。内容procedure1检验员应根据培养基配制程序或培养基各自的说明书配制培养基。2试验用菌种及培养基2.1菌种:2.1.1培养基灵敏度测试所用的菌株传代次数不得超过5代，从国家药检所或菌种保藏中心购买。2.1.2枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[ATCC6633]2.1.3大肠埃希菌(Escherichiacoli)[ATCC8739]2.1.4金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[ATCC6538]2.1.5白色念珠菌(Candidaalbicans)[ATCC10231]2.1.6黑曲霉(Aspergillusniger)[ATCC16404]2.1.7伤寒沙门菌(Salmonella)[ATCC14028]2.1.8铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[ATCC9027]2.2培养基2.2.1按照培养基说明书进行配制灭菌。2.2.2大豆酪蛋白消化肉汤Soybean-CaseinDigestBroth2.2.3大豆酪蛋白消化琼脂Soybean-CaseinDigestAgar2.2.4沙氏葡萄糖琼脂SabouraudDextroseAgar2.2.5肠道菌增菌肉汤EnterobacteriaEnrichmentBrothMossel2.2.6紫红色胆汁葡萄糖琼脂VioletRedBileGlucoseAgar2.2.7麦康凯肉汤MacConkeyBroth2.2.8麦康凯琼脂MacConkeyAgar2.2.9RV沙门氏菌富集肉汤RappaportVassiliadisSalmonellaEnrichmentBroth2.2.10木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂XyloseLysineDeoxycholateAgar2.2.11甘露醇氯化钠琼脂培养基MannitolSaltAgar2.3微生物计数培养基的适用性检查2.3.1微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。2.3.2菌悬液的制备名称金黄色葡萄球菌ATCC6538铜绿假单胞菌ATCC9027菌株制备大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂30℃-35℃，18-24小时大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂30℃-35℃，18-24小时名称枯草芽孢杆菌ATCC6633白色念珠菌ATCC10231菌株制备大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂30℃-35℃，18-24小时沙氏葡萄糖琼脂20℃-25℃，2-3天名称黑曲霉ATCC16404菌株制备沙氏葡萄糖琼脂20℃-25℃，5-7天或者直到形成良好的孢子状态2.3.3上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.2磷酸盐缓冲液制成每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液，制备黑曲霉孢子悬浮液时，添加3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.2磷酸盐缓冲液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%菌氯化钠溶液或pH7.2磷酸盐缓冲液制成每1ml含孢子数不大于100cfu的孢子悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。2.4大豆酪蛋白消化肉汤促生长试验2.4.1取以上前3种菌悬液各0.1ml(不大于100cfu)，分别注入灭过菌的含有10ml大豆酪蛋白消化肉汤的试管中，于30℃-35℃培养不超过3天。同时用相应的上一批通过促生长试验的培养基替代被检培养基进行上述试验。培养结束后进行观察，如果肉眼能清晰看到的微生物的生长与上一批通过促生长试验的培养基的生长情形基本一致，则判定此培养基通过促生长试验。反之则判定此培养基不符合规定，未通过促生长试验。2.5大豆酪蛋白消化琼脂和沙氏葡萄糖琼脂促生长试验2.5.1取以上5种菌悬液各1ml（不大于于100cfu），分别注入无菌平皿中，立即倾注大豆酪蛋白消化琼脂，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀、凝固，置30℃-35℃培养不超过3天，计数，后2种菌悬液不超过5天，计数。再取后2种菌悬液各少于100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀、凝固，置20℃-25℃培养不超过5天，计数。同时用相应的上一批通过促生长试验的培养基替代被检培养基进行上述试验。进行促生长试验的培养基平皿上，微生物生长情况必须与已通过促生长试验的培养基平皿上的微生物生长情况一致或者更好，同时将待测定的培养基上的菌落数与已通过促生长试验的培养基上的菌落数对比，两者之间的比值应处于70%-200%之间,则判定此培养基通过促生长试验；反之则判定该培养基不符合规定，未通过促生长试验。2.6控制菌测试所用培养基的适用性检查2.6.1控制菌检查用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。2.6.2菌悬液的制备序号试验菌种菌株培养1金黄色葡萄球菌ATCC6538大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂30℃-35℃，18-24小时2铜绿假单胞菌ATCC9027大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂30℃-35℃，18-24小时3枯草芽孢杆菌ATCC6633大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂30℃-35℃，18-24小时4大肠埃希菌ATCC8739大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂30℃-35℃，18-24小时5鼠伤寒沙门菌ATCC14028大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂30℃-35℃，18-24小时2.6.3上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.2磷酸盐缓冲液制成适宜浓度的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。2.6.4控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括培养基的促生长能力、抑制能力及指示能力的检查。各培养基的检查测试项目及所用菌株见下表控制菌检查培养基特性试验菌株胆汁耐受革兰氏阴性菌的检测肠道菌增菌肉汤培养基促生长能力大肠埃希菌铜绿假单胞菌抑制能力金黄色葡萄球菌紫红色胆汁葡萄糖琼脂促生长能力+指示能力大肠埃希菌铜绿假单胞菌大肠杆菌的检测麦康凯肉汤促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌麦康凯琼脂培养基促生长能力+指示能力大肠埃希菌沙门氏菌的检测RV沙门氏菌富集肉汤促生长能力鼠伤寒沙门菌抑制能力金黄色葡萄球菌木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基促生长能力+指示能力鼠伤寒沙门菌铜绿假单胞菌的检测溴化十六烷三甲基铵琼脂促生长能力铜绿假单胞菌抑制能力大肠埃希菌金黄色葡萄球菌的检测甘露醇氯化钠琼脂培养基促生长能力+指示能力金黄色葡萄球菌抑制能力大肠埃希菌2.7液体培养基促生长能力检查取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100cfu）（见上表）于被检培养基和上一批检验并通过的培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。两者比较，被检培养基与上一批检验并通过的培养基比较，微生物生长良好并且相当。2.8固体培养基促生长能力检查取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100cfu）（见上表）分别涂布于被检培养基和上一批检验并通过的培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。两者比较，被检培养基与上一批检验并通过的培养基比较，微生物生长良好并且相当。2.9液体培养基和固体培养基的抑制能力检查取试验菌各0.1ml（含菌数不小于100cfu）（见上表）于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养，试验菌应不得生长。2.10培养基指示能力检查取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100cfu）（见上表）分别涂布于被检培养基和上一批检验并通过的培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间范围内培养。被检培养基中生长的菌落在外观和指示反应上与从此前已检测并批准的培养基批次所获得的菌落是相当的。3参考文件CurrentUSP、BP、EP附件及相关文件AttachmentandrelateddocumentsR01微生物计数固体培养基适用性检查记录R02微生物计数液体培养基适用性检查记录R03微生物控制菌培养基适用性检查记录历史History修订号生效日期修订内容001.培养基促生长、抑制能力等规定了试验菌的取样量。附件编号AttachmentNo.:R01微生物计数固体培养基适用性检查记录GrowthpromotiontestofsolidmediaforMicrobialenumerationtest培养基名称厂家/批号配制后批号有效期至检验日期培养温度培养箱编号有效期至对照批号有效期至检验员1操作步骤1.1使用0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液制备测试菌悬液，制备黑曲霉孢子悬浮液时，可以添加0.05%的聚山梨脂80到缓冲液中。测试菌悬液应在两小时内使用，或者在2-8℃的条件下24小时内使用。1.2取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉5种菌悬液各少于100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注大豆酪蛋白消化琼脂，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀、凝固，置30℃-35℃培养不超过3天，计数；后2种菌悬液不超过5天，计数。再取后2种菌悬液各少于100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀、凝固，置20℃-25℃培养不超过5天，计数。取铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌2种菌悬液各少于100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注R2A,每株试验菌平行制备2个平皿，混匀、凝固，置30℃-35℃培养不超过3天。同时用相应的上一批通过促生长测试的培养基替代被检培养基进行上述试验。1.3进行促生长试验的培养基平皿上，微生物生长情况必须与已通过促生长测试的培养基平皿上的微生物生长情况一致或者更好，同时将待测定的培养基上的菌落数与已通过促生长测试的培养基上的菌落数对比，两者之间的比值应处于70%-200%之间,则判定此培养基通过促生长测试；反之则判定该培养基不符合规定，未通过促生长测试。2记录：菌种菌液批号开始培养时间/温度结束培养时间/温度测试培养基菌落数对照培养基菌落数对比生长情况（基本一致或更好）两者比值（70%-200%之间）观察员结果判定平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均附件编号AttachmentNo.:R02微生物计数液体培养基适用性检查记录GrowthpromotiontestofliquidmediaforMicrobialenumerationtest培养基名称厂家批号配制后批号有效期至培养箱编号有效期至对照批号有效期至检验员检验日期1操作步骤1.1使用0.9%无菌氯化钠溶液或PH7.2磷酸盐缓冲液制备测试菌悬液。测试菌悬液应在两小时内使用，或者在2-8℃的条件下24小时内使用。1.2取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3种菌悬液各少于100cfu，分别注入灭过菌的含有10ml大豆酪蛋白消化肉汤的试管中，于30℃-35℃培养不超过3