STR片段分析相关知识

6/1/2020|©LifeTechnologies™1STR片段分析技术相关知识肖怀东FieldApplicationSpecialistTel:4008208982/8008208982E-mail:[e-mail]6/1/2020|©LifeTechnologies™2摘要基本概念回顾片段分析技术原理及过程常见影响分型因素6/1/2020|©LifeTechnologies™3基本概念回顾6/1/2020|©LifeTechnologies™4基本概念回顾基本概念——染色体、DNA、基因、遗传标记、等位基因等分子遗传标记的发展STR概念及相关特性6/1/2020|©LifeTechnologies™5TargetRegionforPCR双链DNA细胞核（cellnucleus）Individualnucleotides染色体（chromosome）22pairs＋XXorXYGene基因——能够表达出特定功能的产物，并决定生物体特定性状的一段DNA序列常用术语染色体——DNA的组装形式，每个人体细胞含有23对染色体6/1/2020|©LifeTechnologies™6常用术语−能够稳定遗传的任何分子特征−个体间有显著差异且易于检测−可位于染色体的任意位置遗传标记（GeneticMarker）6/1/2020|©LifeTechnologies™7第2号染色体第2号染色体D2S118GAGAD2S118GAGAD2S118GAGAD2S118GAGAGAGAGA纯合子杂合子常用术语基因座——遗传标记在染色体上的位置。同源染色体——成对的两条染色体互称为同源染色体等位基因——在同源染色体上占据相同座位上的一对等位基因。D2S1186/1/2020|©LifeTechnologies™8多态性（Polymorphism）−序列多态性，DNA在序列上的变异−长度多态性--------AGACTAGACATT---------------AGATTAGGCATT----------------(AATG)(AATG)(AATG)----------2repeats3repeats---------(AATG)(AATG)----------常用术语6/1/2020|©LifeTechnologies™9分子遗传标记的发展“Ifyouwanttounderstandtoday,youhavetosearchyesterday.”–AttributedtoPearlBuck()TheNobelPrizeinLiterature1938PearlBuck6/1/2020|©LifeTechnologies™10分子遗传标记的发展1985199019941998200020021992200619962004201020082013RFLPSNPGilletal.(1985)ForensicapplicationofDNA'fingerprints‘.Nature318:577-9PCR首次描述20121991STR第一个商业化荧光复合STR试剂盒PCR应用于办案CODISlocidefinedUKNationalDatabaselaunched(April10,1995)STR成为常规使用Identifiler5-dyekitandABI3100首个Y-STR试剂盒miniSTRIdentifilerDirectIdentifilerPlus3500/xlY-DirectGlobalFilerPGMCODISupdate参考Bulter《ForensicDNAtyping》6/1/2020|©LifeTechnologies™11什么是STR?短串联重复序列（Shorttandemrepeat,STR）=微卫星DNA(microsatelliteDNA)=简单重复序列（simplesequencerepeat,SSR)长度多态性遗传标记，一般由2-6个碱基的DNA重复序列组成，其长度多态性来源于重复单位拷贝数的个体差异。常用术语•Dinucleotide•Trinucleotide•Tetranucleotide•Pentanucleotide•Hexanucleotide(CA)(CA)(CA)(CA)(GCC)(GCC)(GCC)(AATG)(AATG)(AATG)(AGAAA)(AGAAA)(AGTACA)(AGTACA)6/1/2020|©LifeTechnologies™125’TCCCAAGCTCTTCCTCTTCCCTAGATCAATACAGACAGAAGACAGGTGGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATCATTGAAAGACAAAACAGAGATGGATGATAGATACATGCTTACAGATGCACAC3’=12GATArepeats(“12”isallthatisreported)Targetregion(shorttandemrepeat)7repeats8repeats9repeats10repeats11repeats12repeats13repeatsThenumberofconsecutiverepeatunitscanvarybetweenpeople6/1/2020|©LifeTechnologies™14适用于法医DNA分型的STR基因座的选择较高的个体识别率，通常0.9，观测杂合度0.7在染色体上定位相对较远，确保无连锁低stutter产物、低突变率与其他遗传标记复合检测时易于得到结果，且具有重现性鉴定的位点越多，判错的可能性越小，个体识别能力越来越强6/1/2020|©LifeTechnologies™15统计学基本概念遗传多态性指控制遗传标记的基因座上存在有两个或两个以上的等位基因，并且等位基因的频率大于0.01.基因频率/等位基因频率指某种等位基因数目占该等位基因上所有等位基因总数目的百分比杂合度（heterozygosity）是一个传统的遗传学指标，指群体中某遗传标记所有基因型中杂合子所占的比例。个人识别率（ProbabiltyofDiscriminationpower,PD)在群体中随机抽取两个体，二者的遗传标记表型不同的概率6/1/2020|©LifeTechnologies™16CSF1POD5S818D21S11TH01TPOXD13S317D7S820D16S539D18S51D8S1179D3S1358FGAVWA13CODISCoreSTRLociAMELAMELSex-typing法医学应用的STR在染色体上的位置CoreSTRLocifortheUnitedStates1997SE3320112012D10S1248D2S441D22S104523D2S1338D19S433D1S1656D12S391DYS3916/1/2020|©LifeTechnologies™176/1/2020|©LifeTechnologies™18STR的特性分布广泛，有高度多态性。检测方法简单。扩增片段短，适用于降解、陈旧和腐败检材的分型鉴定。复合扩增，可以实现自动化操作，节约时间、节约检材、提高检测效率。目前，STR已广泛应用于遗传制图、连锁分析、亲子鉴定、个体识别、疾病基因定位和物种多态性研究等领域。常用术语6/1/2020|©LifeTechnologies™19片段分析技术原理及过程6/1/2020|©LifeTechnologies™20STR片段分析的原理除同卵双生外，每个人/生物包含的DNA序列是不同的，独一无二的同一个个体的各种组织DNA具有相同的序列特征（如同一个人来自皮肤的DNA和血液的DNA是一样的，相匹配的）同一个个体的DNA序列在一生当中保持不变（除外某些疾病）同一个个体的DNA一半来自母亲，一半来自父亲6/1/2020|©LifeTechnologies™21样本采集样本制备/样本提取FLOQSwab™PrepFilerExpress™PrepFilerExpress™BTAAutoMateExpress™扩增检测&数据分析STR片段分析的过程定量7500HIDRealTimePCRAnalysisSoftware6/1/2020|©LifeTechnologies™22样本采集样本制备/样本提取扩增检测&数据分析定量STR片段分析的过程样本采集FLOQSwab™6/1/2020|©LifeTechnologies™23生物物证的采集DNA是否能开展应用，现场采集至关很重要直接提取转移提取：擦拭、粘取、吸取等FibreSwabFLOQSwab™6/1/2020|©LifeTechnologies™24生物物证的采集DNA是否能开展应用，现场采集至关很重要直接提取转移提取：擦拭、粘取、吸取等单细胞捕获ArcturusXT™LCM6/1/2020|©LifeTechnologies™25生物物证的采集DNA是否能开展应用，现场采集至关很重要采集工具/介质无人类DNA，DNA酶和RNA酶高效收集（最大量、操作简便）无人体侵害性转移步骤少可自动化，易存储BodeBuccalCollector™CopanNUCLEICard™System6/1/2020|©LifeTechnologies™26样本采集样本制备/样本提取扩增检测&数据分析定量STR片段分析的过程样本制备/样本提取PrepFilerExpress™PrepFilerExpress™BTAAutoMateExpress™6/1/2020|©LifeTechnologies™27样本制备利于峰均衡性利于得到好的峰高利于减少杂峰用于口腔拭子和未经处理的采集卡Prep-n-Go™BufferBSD及打孔[e-mail]6/1/2020|©LifeTechnologies™28使用PrepFiler™Express™试剂盒，专用于法医样品提取，以获得高质量DNA——使用简单、可靠——操作时系统密闭，避免污染——30分钟内可同时处理13个样本（使用LySep柱简化了裂解过程）——提取的DNA完整、无抑制物——针对定量和片段分析试剂盒进行了验证样本提取6/1/2020|©LifeTechnologies™29样本采集样本制备/样本提取扩增检测&数据分析定量STR片段分析的过程定量7500HIDRealTimePCRAnalysisSoftware6/1/2020|©LifeTechnologies™30定量准确的定量在法医DNA检测过程中至关重要过多的DNA会导致off-scale峰,分裂峰(由于noise或+A),滑移峰和其他颜色的渗透峰.过少的DNA导致位点丢失、峰高不平衡指导后续试验选择试剂盒D3S1358-A+A10ngtemplate(overloaded)2ngtemplate(suggestedlevel)DNASize(bp)RelativeFluorescence(RFUs)DNASize(bp)100pgtemplate5pgtemplateWegenerallyshootfor0.5-2ng6/1/2020|©LifeTechnologies™31定量仪器7500定量试剂盒的选择Quantifiler™HumanDNAQuantificationKitQuantifiler™YHumanMaleDNAQuantificationKitQuantifiler™DuoDNAQuantificationkit6/1/2020|©LifeTechnologies™32样本采集样本制备/样本提取扩增检测&数据分析定量STR片段分析的过程扩增6/1/2020|©