第八章酶定向进化

1/169蛋白质与酶工程ProteinandEnzymeEngineering1/169第八章酶定向进化DirectedEvolutionofEnzyme2/169主要内容第一节酶定向进化介绍第二节酶基因体外随机突变第三节酶突变基因的定向选择第四节酶分子定向进化的应用第一节酶定向进化介绍3/169获得具有新功能和特性的酶的途径(2)改造现有已知的酶。4/169(1)从大量未知的生物种系中寻找生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中，并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内的一系列酶在发挥着作用。酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。天然酶的作用5/1696/169天然酶的局限性酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求稳定性差活性低使催化效率很低缺乏有商业价值的催化功能天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。7/169现代生物工程对酶的要求1、能具备长期稳定性和活性2、能适用于水及非水相环境3、能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物4、进一步增强酶对多种底物的分解能力生物的自然进化进化过程：突变→自然选择→遗传后代进化结果：基因多样性：为完成同一功能所表现出的多个基因或同一个基因(同源性)代谢途径的多样性：同样产物，多条途径代谢产物的多样性：同一底物，不同产物8/169如何利用相对简单快速的方法对天然酶的改造或构建新的非天然酶？9/169酶的人工改造酶的理性设计(Rationaldesign)酶的定向进化(Directedevolution)10/169酶的理性设计在对酶的空间结构和催化机理有非常充分了解的基础上，对酶的结构进行精确的调控，从而获得具有所需催化活性的新酶11/169理性设计示意图12/169理性设计的不足只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换、删除或插入，不改变酶蛋白的高级结构，因而对酶功能的改造较有限。本法仅适用于三维结构清楚、结构和功能的相互关系也较清楚的酶。当对酶结构不甚了解时，定点突变就无能为力了。13/169定向进化定向进化是模拟自然进化的过程，进行人工随机突变，并在特定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需要的方向发展的技术过程。14/169定向进化示意图15/169定向进化的分类按照进化对象的不同，分为：分子定向进化细胞定向进化16/169细胞定向进化细胞定向进化是在细胞水平上进行定向进化的过程，以各种细胞为进化对象，目的是改良细胞的各种特征，主要包括微生物细胞的定向进化、动物细胞的定向进化、植物细胞的定向进化等。基因组重排技术通过把诱变与细胞融合技术相结合，对细胞进行基因组重排，从而大幅度增加细胞的正突变频率。17/169分子定向进化分子定向进化是在分子水平上进行定向进化的过程。分子定向进化首先要通过从细胞内提取或者通过PCR等方法获得目标分子的基因，在体外采用易错PCR、ＤＮＡ重排、基因家族重排等技术进行人工突变，然后进行定向选择而获得所需突变体。18/16919/169酶分子定向进化模拟自然进化过程（随机变异和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。酶分子定向进化的原理定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的20/16921/169酶定向进化的基本过程随机突变酶基因随机突变构建突变基因文库筛选负突变基因正突变基因进化酶反复进行易错PCRDNA重排基因家族重排平板筛选法荧光筛选法噬菌体表面展示法细胞表面展示法核糖体表面展示法高通量筛选定向选择定向进化的选择策略1、定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。2、通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。22/169定向进化研究的历史1萌芽阶段首先在分子水平上进行改造单一分子的是SolSpiegelman。在20世纪60年代,利用RNA噬菌体Q进行的试验,证明达尔文的自然选择也可在非细胞体进行.23/1692奠基阶段1981年，HallBG等报道了他们定向改变了大肠杆菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。HallBG等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌，分别在含有某种碳源的培养基上培养．从酶的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖、乳果糖、乳糖酸的突变酶，而野生型的酶不能水解这些底物。24/1693发展阶段易错PCR(error-pronePCR)和DNA改组方法被成功开发,标志着酶分子定向进化技术的成熟.1992年GramH．等用噬菌体呈现技术体外筛选抗体时，用易错PCR向抗体的重链可变区和轻链可变区引入突变。Stemmer将DNA改组方法引用到酶分子定向进化中，他用β内酰胺酶作为模型分子，对其正向突变库进行DNA改组，以逐渐增加头孢氨噻的浓度为筛选压力，经过三轮DNA改组获得酶活力增加32000倍的突变体。25/169酶定向进化的意义酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围能够解决理性设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。26/169酶定向进化的用途(1)提改变酶的特性----多功能或单功能酶(2)提高酶活性---天门冬氨酸氨基转移酶活性提高30倍(3)改变底物特异性和对映异构体选择性----酯酶可水解非天然酯类(4)改变酶的工艺性----冷适应和热适应酶(5)改善酶的稳定性----二体酶变为单体酶或单体酶变为二体酶(6)获取许多新的理论知识27/169酶性质突变方法枯草杆菌蛋白酶E有机相活性/稳定性易错PCRβ-内酰胺酶总活力/底物专一性DNA改组枯草杆菌蛋白酶BPN′稳定性盒式诱变对硝基苯酯酶底物专一性/有机相活性易错PCR/DNA改组胸腺嘧啶核苷激酶底物专一性盒式诱变β-半乳糖苷酶底物专一性DNA改组绿色荧光蛋白荧光DNA改组核酶底物专一性易错PCR/DNA改组天冬氨酸酶活性与稳定性随机/定位诱变药物和疫苗活性/专一性/最佳表达DNA改组酶的体外定向进化应用实例28/169理性设计与非理性设计的对比理性设计（定点突变）对蛋白结构和功能关系比较清楚，设计一定蛋白结构（如一级结构的氨基酸序列）来改变蛋白功能非理性设计（定向进化）无需知道蛋白结构和功能关系，直接筛选适合（催化）功能的蛋白酶，再了解这些高活力酶蛋白对应的结构29/169新酶设计的策略30/16931/169第二节酶基因体外随机突变获取新基因的方法环境样品产酶微生物的筛选微生物发酵产酶酶蛋白的分离纯化酶蛋白的氨基酸序列的测定微生物的分子鉴定数据库中寻找酶蛋白序列酶蛋白序列比对及保守区确定设计简并引物并扩增保守区序列酶基因32/1698.2酶基因体外随机突变8.2.1PCR技术介绍多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。33/169体内DNA的复制体系DNA聚合酶（IIIIII）拓扑异构酶解旋酶类SSB引物dNTPMg2+5’3’34/1698.2.1PCR技术介绍Mullis的PCR构思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段35/1698.2.1PCR技术介绍TaqP1P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反应缓冲液辅助因子：Mg2+36/1698.2.1PCR技术介绍PCR反应循环72℃94℃55℃PCR循环变性-提供单链模板退火-接上杂交引物延伸-高效聚合核苷酸37/1698.2.1PCR技术介绍PCR的指数扩增（2n）引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火38/1698.2.1PCR技术介绍39/1698.2.2基因体外随机突变方法随机突变方法特点易错PCR技术error-pronePCR从酶的单一基因出发，在特定的反应条件下进行PCR扩增，使碱基配对出现错误而引起基因突变基因重排技术DNAshuffling从两条以上的正突变基因出发，经过酶切和不加引物的PCR扩增，使碱基序列重新排布而引起基因突变基因家族重排技术DNAfamilyshuffling从基因家族的若干基因出发，经过酶切和不加引物的PCR扩增，使碱基序列重新排布而引起基因突变40/169一、易错PCR技术易错PCR技术(error-pronePCR)是从酶的单一基因出发，在改变反应条件下进行聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。(1)易错PCR反应过程①双链DNA变性：85-95℃②引物与单链DNA退火结合：50-70℃③引物延伸：70-75℃8.2.2基因体外随机突变方法41/169(2)易错PCR反应条件①Mg2+浓度较高，以稳定非互补的碱基对。普通PCRMg2+浓度0.5-2.5mmol/L，易错PCR提高Mg2+浓度。②添加Mn2+，以降低聚合酶对模版的特异性。③4种底物的浓度比改变，即采用浓度不平衡的各种底物，使碱基配对错误出现频率增加。易错PCR具体反应条件要根据进化目的、DNA聚合酶种类和模版情况等多次试验而确定。8.2.2基因体外随机突变方法--易错PCR技术42/16943/169易错PCR示意图8.2.2基因体外随机突变方法--易错PCR技术44/169易错PCR注意事项易错PCR,遗传变化只发生在单一分子内部,所以属于无性进化（asexualevolution）。采用易错PCR时，要控制好适当的突变频率。突变频率太低，难于筛选到理想的正突变体突变频率太高，增加筛选工作量（大多突变为负突变和中性突变）一般情况下,一个目的基因通过易错PCR引起的错配碱基数目控制在2-5个。通常采用连续易错PCR(SequentialerrorpronePCR)：将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板,连续反复进行随机诱变。8.2.2基因体外随机突变方法--易错PCR技术45/169易错PCR应用实例Chen.K和Arnold采用易错PCR对枯草杆菌蛋白酶进行了体外进化研究。他们通过降低反应体系中dATP的浓度,对编码该酶从第49位氨基酸到C端的DNA片段进行易错PCR,经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺(DMF)中酶活性明显提高,其中突变体PC3在60%的DMF中,酶活力是野生型的256倍。将PC3再进行两个循环的定向进化,得到的突变体酶活力比PC3还要高3倍。8.2.2基因体外随机突变方法--易错PCR技术46/169易错PCR特点：操作简便，随机突变丰富正突变概率低，突变基因文库较大，筛选工作量大适合较小基因（＜800bp）的定向进化8.2.2基因体外随机突变方法--易错PCR技术47/169二、DNA重排技术DNA重排（DNAshuffling）技术又称DNA改组技术，是从两种以上的同源正突变基因出发，用酶切成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。此方法又称为有性PCR(SexualPCR),通过将亲本基因群中的突变尽可能组合在一