质粒DNA提取

质粒DNA提取(碱裂解法)1.实验目的2.实验原理3.实验仪器、材料与试剂4.实验步骤5.实验结果及讨论实验目的了解碱裂解法提取质粒的原理；掌握碱裂解法提取质粒的方法。实验原理质粒：是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒：是实验室常用的制备质粒的方法。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。载体基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体，主要有大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒等作为基因工程用的载体必须具备以下条件：起始复制子有一个或多个利于检测的遗传表型有一系列限制性内切酶的单一识别位点（多克隆位点）适当的拷贝数基本结构的三大要素：•多克隆位点•选择标记（耐药性，LacZ）•独立的复制子种类：•质粒•噬菌体•酵母人工染色体（YAC）•反转录病毒载体•表达载体等质粒质粒是基因工程中常用的载体之一，是染色体外小型双链环状DNA，大小在1～200kb之间，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些植物细胞中，在细菌中最多。T-载体在碱性条件（pH12.5）下，细菌的线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA、细菌碎片、蛋白-SDS一起被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中。RNA通过胰RNA酶A水解用乙醇沉淀并洗涤，可得到较纯的质粒DNA。碱裂解法原理实验仪器、材料与试剂（一）仪器1.恒温摇床：培养细菌使质粒扩增2.超净工作台：在培养基中接种细菌3.高压灭菌锅：防止其它细菌的污染4.台式离心机：沉淀细菌、分离质粒与细菌DNA以及蛋白、乙醇沉淀质粒DNA5.微量移液器：吸取一定体积的溶液（二）材料含pGEXP-4T质粒的大肠杆菌DH5α。—已转化含重组质粒的大肠杆菌DH5α。—已培养（三）试剂LB液体培养基胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g加去离子水至800ml搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20分钟。LB固体培养基在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。1.SolutionⅠ50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)高压灭菌后，4℃保存备用。2.SolutionⅡ(现用现配，pH12-12.5)0.2mol/LNaOH1%SDS3.SolutionⅢ（pH4.8）5mol/LKAc60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml配制成的溶液Ⅲ含3mol/L钾盐、5mol/L醋酸5.酚:氯仿：进一步去除含有质粒DNA的上清中的细菌蛋白和脂类6.预冷的70%乙醇：洗涤DNA沉淀以去除沉淀中带有的少量盐和蛋白7.胰RNA酶A:去除细菌RNA将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris.Cl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。实验步骤在50mL含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基中，接入含pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜（12h-16h）收菌，吸取1.4mL培养物加入1.5mL离心管中，5000r/min室温离心2min；吸去培养液，可以将离心管倒扣在干净卫生纸上使细菌沉淀尽可能干燥；将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混匀，室温放置3min；加入200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧盖子，颠倒数次，混匀内容物，将离心管放冰上3-5min(不得超过5min)；加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧盖子，颠倒数次混匀。冰上放置5min；12000rpm离心8min，离心后将上清转至另一新离心管中；向上清中加入等体积酚:氯仿（1:1），反复混匀，12000rpm离心5min，将上清转至另一离心管中；向上清中加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温（建议冰上）放置5～10min；12000rpm离心5min，倒去上清，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体（注意观察离心管底部是否有白色沉淀，如果有，可以用记号笔做个标记）；用1mL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，12000rpm离心5min，倒去乙醇，空气干燥；在干燥后的离心管中加20μL含20μg/mL胰RNA酶的水溶液，37℃保温10min，使质粒DNA完全溶解，置-20℃保存；在下次实验中通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA。总体流程图一：碱裂解法提取质粒DNA的原理二：质粒提取过程中的注意事项三：实验结果与讨论碱裂解法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作。实验中酚氯仿的作用？加入胰RNA酶的作用？70%乙醇的作用？你在实验中遇到的问题及如何解决例如：有蛋白质残留，DNA沉淀干燥后不透明，呈白色。实验报告