基因表达与调控的研究技术

基因表达与调控的研究技术学号：2111405110DNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录RNA复制中心法则(thecentraldogma)：–基因表达(geneexpression)--基因转录及翻译的过程。•rRNA、tRNA的合成属于基因表达细胞在生命过程中，把蕴藏在DNA中的遗传信息经过转录和翻译，转变成为具有功能的蛋白质分子的过程称为基因表达。围绕基因表达过程中发生的各种各样的调节方式都通称为基因表达调控。基因表达与基因表达调控真核生物中，从个体的生长、发育、衰老、死亡，到组织的分化、凋亡以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因的选择性表达。高等生物大约有30000个不同的基因，但在生物体内任意细胞中只有10%的基因得以表达，而这些基因的表达是按时间和空间顺序有序地进行着，这种表达的方式即为基因的差异表达。其包括新出现的基因表达与表达量有差异的基因表达。生物体表现出的各种特性，主要是由于基因的差异表达引起的。由于基因差异表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制，通过比较同一类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为分析生命活动过程提供重要信息。研究基因差异表达的主要技术有差别杂交(differentialhybridization)，扣除（消减）杂交(Subtractivehybridization)，mRNA差异显示技术(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionPCR,DDRT-PCR)，抑制消减杂交法(suppressialsubstractivehybridization,SSH)，代表性差异分析(Representialdisplayanalysis,RDA)，交互扣除RNA差别显示技术(RSDD)，以及基因表达系列分析和电子消减差减杂交(subtractivehybridization,SH)差减杂交(SH)是20世纪80年代应研究真核生物基因差异表达需要而发展起来的一种基因差示筛选方法，在原核生物研究中也同样适用。可以有效地分离两种细胞样本中存在差异的核酸成分。原理:待测样品中包含需要分离的差别表达cDNA，而对照样品（以过量的生物素标记）中则不包含这些序列，来自待测和对照样品的cDNA在对照样品过量的情况下进行杂交，只有来自测试和对照样品的共有序列才能进行杂交形成双链杂合体，去除双链杂合体和未杂交的对照样品序列后（利用生物素和亲和素结合），获得来自测试样品中的特有序列。差减杂交技术原理差减杂交（SH）具有富集作用，有利于克隆低丰度基因，假阳性比率较低，效率比较高，可以构建文库。常用方法：代表性差异分析(representationaldifferenecanalysis,RDA)抑制性差减杂交(suppressionsubtractivehybridizationSSH)酶降解差减杂交(enzymaticdegradingsubtraction,EDS)接头捕获差减杂交(linkercapturesubtractionLCS)代表性差异分析(representationaldifferenceanalysis,RDA)代表性差异分析（RDA）用于筛选两个样本中基因组DNA之间的差异基因片段。在此基础上又发展为cDNA-RDA技术，用于筛选差别表达基因。基本原理：其原理是将差减杂交与PCR结合,根据以双链DNA为模板进行PCR扩增时产物呈指数扩增,而以单链DNA为模板则呈线性扩增的原理,首先提取待测组和对照组的总RNA或mRNA,反转录成cDNA,用识别4个碱基的内切酶(如DpnⅡ)充分消化,然后进行PCR,使两组cDNA片段得以富集,接着连续进行若干次差减杂交,去除共有基因。最后利用PCR技术富集实验组特异表达基因的cDNA片段。基本步骤：首先提取待测组和对照组样品的mRNA，合成双链cDNA；用DpnⅡ酶切两组双链cDNA进行消化。两端接上单链接头1，补平后，用含接头1序列的引物PCR扩增，再用DpnⅡ去除双链cDNA两端的接头1；只给予待测组双链cDNA两端再接上单链接头2。将待测组与对照组cDNA杂交，杂交反应体系中只有待测组自身杂交形成的双链cDNA才两端都带接头2，补平，用含有含有接头2序列的引物PCR扩增，待测样品中特有的DNA序列两条链含接头2，因此成指数增长，而只有一端带接头2的杂交体只能被线性扩增。将此杂交产物再进行第二轮酶切、加接头、杂交和PCR扩增，重复两次后，可确保从实验组中彻底去除与对照组共有的序列。优势：（1）高效性，与传统的差减富集相比，更加敏感，可以筛选出低拷贝的差异基因；（2）可靠性，结果重复性好，假阳性率非常低。有人曾结合cDNA-RDA和膜杂交筛选，对比正常人口腔黏膜上皮和HPV永生化的口腔上皮细胞系，获得了384个差异表达的克隆，并证实其中含69种差异基因。cDNA-RDA技术的局限性在于：（1）得到的差异片段是平均为300~600bp的小片段。（2）由于cDNA较基因组DNA短，消化后可造成cDNA序列两端信息量丢失。（3）完全无酶切位点的片段无法参与RDA筛选。（4）在极低拷贝差异基因的筛选上进行了改进，但仍有不足。抑制差减杂交法(suppressionsubtractivehybridization，SSH）1996年，L.Diathebko在RDA的基础上建立了抑制性减法杂交技术，该技术是RDA技术的发展。抑制差减杂交是一种高效鉴定与分离克隆差异基因的新技术，是在抑制PCR基础上的消减杂交，使差异表达基因富集。抑制PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，使非目标序列片段两端的长反向重复序列在复性时产生“锅柄样”结构或“发夹结构”而无法于引物配对，从而选择性的抑制非目标序列的扩增。不同丰度的单链DNA得到均衡杂交动力学目的基因得到富集抑制性PCR抑制性消减杂交—原理1516抑制差减杂交技术运用了杂交二级动力学原理,即高丰度的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度快于低丰度的单链cDNA,在试验组(tester)和驱动组(driver)的cDNA变性后再复性的过程中,原来在丰度上有差别的单链cDNA达到均一化。杂交动力学采用两次消减杂交和两次PCR，保证了高特异性；通过杂交操作，可以获得低丰度差异表达基因；操作简便，实用有效，全过程仅需3-4天。抑制性消减杂交—特点17由RNA合成cDNARsaI限制性内切酶酶切cDNA末端接头连接第一次消减杂交第二次消减杂交第一次PCR扩增第二次PCR扩增富集差异表达基因末端补齐实验流程TestercDNA+Adaptor1TestercDNA+Adaptor2R由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接头连接第一次消减杂交第二次消减杂交第一次PCR扩增第二次PCR扩增富集差异表达基因末端补齐实验流程TestercDNAwithAdaptor1TestercDNAwithAdaptor2RDrivercDNA（过量）ABCDABCD由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接头连接第一次消减杂交第二次消减杂交第一次PCR扩增第二次PCR扩增富集差异表达基因末端补齐实验流程ABCDTester杂交液（Adaptor1）ABCDTester杂交液（Adaptor2R）DrivercDNA（加热变性）A,B,C,DE由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接头连接第一次消减杂交第二次消减杂交第一次PCR扩增第二次PCR扩增富集差异表达基因末端补齐实验流程A,B,C,DABCDE末端补齐EE21由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接头连接第一次消减杂交第二次消减杂交第一次PCR扩增第二次PCR扩增富集差异表达基因末端补齐实验流程ABCDE加入共用PCR引物A,D:不能被扩增C:线性扩增B:扩增受到抑制E5’3’3’5’EE非特异性表达基因得到极大的扣除，高效地富集了差异表达基因。由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接头连接第一次消减杂交第二次消减杂交第一次PCR扩增第二次PCR扩增富集差异表达基因末端补齐实验流程E5’3’3’5’加入巢式PCR引物E23①灵敏度高;一般说来,经过SSH,稀有丰度的cDNA能富集1000倍~5000倍,这种富集作用使得低至每细胞一个拷贝的分子也有可能被检出;②提高了基因克隆的效率;由于使用4碱基内切酶使得基因(组)的复杂程度降低,大大提高了信息量,在一次SSH试验中可同时分离出上百个差别表达的基因;③假阳性率低;④操作简单,速度快,效率高;一次SSH可以同时分离到几十甚至几百个差异表达的基因;⑤PCR产物既可用作探针作文库筛选,也可直接进行克隆,构建差减文库。SSH是目前为止较为简单有效的寻找差异基因的方法,其主要优点:SSH技术对其实材料要求多SSH技术得到的cDNA是限制酶消化的cDNA，不再是全场cDNA所研究材料的差异不能太大缺点差异显示技术(differentialdisplay,DD)差异显示(differentialdisplay,DD)是1992年由美国波斯顿Dena-Faber癌症研究所的LiangPeng博士和ArthurPardee博士建立的筛选基因差异表达的有效方法。是将mRNA反转录技术和PCR技术二者结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术，因此也称为DDRT-PCR。每一种细胞组织（同一组织细胞经不同的处理）都有其特异表达的不同于其他组织细胞的基因普，即特异的RNA指纹图谱。早期，从mRNA转录水平筛选差异表达基因的方法是差别筛选技术和差减杂交法，但二者存在灵敏度低、工作量大、周期长及步骤繁琐的问题。哈佛大学医学院Liang和Struss博士发明了mRNA差异显示技术，即DDRT—PCR(differ—entialdisplayofmRNAbyPCR)。1994年，ErricHaay等将这种方法正式命名为差异显示反转录聚合酶链式反应(mRNADifferentialDisplayPCR)，简称DDRT—PCRmRNA差异显示技术的原理：mRNA差异显示技术的主要原理是利用cDNA反转录技术,PCR扩增和高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，来显示PCR产物的差异。其中，反转录技术中使用了一系列能与mRNA的Poly（A）尾巴相结合的锚定寡聚脱氧核苷酸引物oligoT12MN。锚定引物与mRNA的Poly（A）+的两个碱基，在反转录酶的作用下可以启动mRNA群体反转录。5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’锚定引物逆转录5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’变性5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’锚定引物寡核苷酸随机引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延长dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’变性、退火、延伸电泳显示T12MN(M为A、G、C，N为A、T、G、C)启动cDNA第一链合成不同长度的PCR产物回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对随机结合到cDNA链上mRNA差异显示技术简略流程图DDRT-PCR的优点以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础灵敏度高，仅需0.2μg的总RNA可以同时比较多个样品间基因表达的差异可以同时检测到“上调”及“下调”的基因时间短，实验过程中可步步验证比较可进行多基因家族的表达分析DDRT-PCR的缺点假阳性高样品mRNA可能有部分降解有少量的DNA污染单条带可能由一种以上cDNA片段所构成有些特异cDNA片段太短,在Northern杂交时检测不到杂交信号PCR扩增了一些稀有mRNA片段,在杂交时显示不出差异表达的信号绝大多数差异条带仅含有3’-UTR500bp以内的一短片段的信息，这些区域的序列结构相对保守，得不到特异的基因对低丰度mRNA检出率低限制性酶切片