6种常见的循环肿瘤细胞的分离与富集技术-蒋能

分子诊断与治疗杂志2017年1月第9卷第1期JMolDiagnTher,January2017,Vol.9No.1基金项目：国家自然科学基金（30900650/H1615，81372501/H1615，81572260/H1615，81172232/H1615，81172564/H162）；广东省自然科学基金（2011B031800025，S2012010008378，S2012010008270，S2013010015327，2013B021800126，20090171120070，9451008901002146，2013B0218001262015A020214010and2013B021800259）；高校基本业务青年重点培育（2015ykzd07）作者单位：中山大学附属第一医院病理科，广东，广州510080★通讯作者：柯尊富，E⁃mail：[e-mail]•述评•循环肿瘤细胞（circulatingtumorcells，CTCs）是指脱离了肿瘤原发部位和转移部位而进入血液循环中的各类肿瘤细胞的统称。根据中国最近的一份肿瘤统计学数据，肿瘤已成为国民死亡的主要原因，同时也是威胁公众健康的主要原因［1］。随着“精准医疗”概念的提出，恶性肿瘤的诊断与治疗也逐步向个体化、精细化方向深入发展，CTCs的研究是精准医疗的重要方向之一，而如何从恶性肿瘤患者血液中分离的CTCs中得到更多的诊断信息和治疗信息将是精准医疗的重要方面，若6种常见的循环肿瘤细胞的分离与富集技术蒋能崔咏梅李淑华郑晓克杨峥王连唐柯尊富★在过去的几十年，循环肿瘤细胞（circulatingtumorcells，CTCs）因其在肿瘤的早期诊断、预后判断、疗效评价、靶向药物的开发、个体化治疗中的潜在作用已经受到了广泛的关注和研究。在转移的肿瘤患者中，循环肿瘤细胞被视为一种微创的极具前景的诊断标志和判断预后的重要标志。许多敏感的筛选方法和设备已经应用于血液中循环肿瘤细胞的分离和富集。本文总结了6种CTCs的分离和富集技术以及他们的优缺点，以期为后续更加优化的新技术、新设备的开发提供更多的参考依据，同时也为后续肿瘤的精准医疗带来一些参考。循环肿瘤细胞（CTCs）；精准医疗；分离与富集6kindsofcommontechnologiesofseparatingandenrichingcirculatingtumorcellsJIANGNeng,CUIYongmei,LIShuhua,ZHENGXiaoke,YANGZheng,WANGLiantang,KEZunfu★(DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,SunYat⁃senUniversity,Guangzhou,Guangdong,China,510080)[ABSTRACT]Duringthepasttenyears,circulatingtumorcells(CTCs)havereceivedenormousattentionaspotentialresearchdirection,becauseofthepotentialvalueintheearlydiagnosisofcancer,predictionofclinicalprognosis,evaluationoftherapeuticefficiency,developmentoftargeteddrugs,andpersonalizedmedicineofmalignantcancer.Circulatingtumorcells(CTCs)havebeenregardedasminimallyinvasiveandpromisingdiagnosticandprognosticbiomarkersforpatientswithmetastatictumors.MultiplehighlysensitiveapproachesanddeviceshavebeendevelopedtoseparateandenrichCTCsintheblood.Wehavesummarized6kindsofseparationandenrichmenttechnologiesofCTCswiththeopportunitiesandchallengesfacedduringthedevelopmentofthesesystems,thisarticlealsoprovidesreferenceframeforanoptimizedseparationandenrichmenttechnologyandhighlightsomedirectionsfortheprecisionmedicineofcancertreatment.[KEYWORDS]Circulatingtumorcells(CTCs);Precisionmedicine;Separationandenrichment··1分子诊断与治疗杂志2017年1月第9卷第1期JMolDiagnTher，January2017，Vol.9No.1能应用于医学领域，将有效地帮助发现肿瘤的早期转移、评估肿瘤患者预后以及帮助判断肿瘤个体化治疗的疗效，实时动态地分析肿瘤患者CTCs的特性将为肿瘤患者真正的个体化治疗提供新的依据［2⁃4］。目前的研究表明，CTCs的分离和富集是一种极具前景的恶性肿瘤监测手段［5⁃6］，与传统肿瘤组织活检相比，检测循环血液中的CTCs被视为一种简单无创的“液体活检”手段［2，7，8］。而如何敏感、准确、快速、高效地分离和富集循环血液中少量的肿瘤细胞是摆在我们面前的难题［9⁃11］，CTCs检测技术的不断改进和发展，将有助于我们更深入地了解肿瘤的发生发展过程和其相关生物学特性。本文归纳总结了常见的6种CTCs分离富集技术，包括NanoVelcrocell⁃affinitysubstratesCTC芯片技术、核酸适配体（Aptamer）技术、微流控芯片技术（microfluidicschiptechnology）、基于形态学的膜微孔过滤技术（Microfiltertechnology）、基于形态学的密度梯度离心法等［2，12］。1CTCs常见的分离与富集技术1.1NanoVelcrocell⁃affinitysubstratesCTC芯片技术NanoVelcroCTC芯片能够牢固高效地捕获CTCs，硅纳米结构基质（Siliconnanowiresubstrate，SiNS）可以模拟细胞外基质的生物学特性和功能，利用纳米基板的生物学特性可以有效地黏附CTCs［2］。此外，可在SiNS上结合上皮细胞黏附分子（epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM）抗体，通过CTCs细胞表面表达的EpCAM抗原与基板上黏附的EpCAM抗体亲和性来有效地捕获血液中的CTCs。通过一系列的改进和创新，NanoVelcroCTC芯片已经经历了3代。第1代是由SiNS和聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）微流体混合器组成，工作部分主要由含有螺旋形（鱼骨型）微通道的NanoVelcro基板和高分子PDMS微通道构成［13］，分离的CTCs通过荧光染色观察，4′，6⁃二脒基⁃2⁃苯基吲哚（4′，6⁃diamidino⁃2⁃phenylin⁃dole，DAPI）染核阳性与CD45染色阳性的细胞为有核白细胞，而DAPI染色阳性与细胞角蛋白（cy⁃tokeratin，CK）染色同时阳性者为需要分离富集的CTCs［2］。临床血液样本对比分析发现NanoVelcroCTC芯片比美国食品药品监督管理局（FoodandDrugAdministration，FDA）批准的CellSearch更加敏感、效率越高、花费更少［14⁃16］。同时，分离的CTCs可用于基因测序等后续研究，是精准医疗不可或缺的重要一环［2］。第2代NanoVelcro⁃LMD技术是在纳米基板聚合物基础上通过聚乳酸⁃羟基乙酸共聚物［Poly（lactic⁃co⁃glycolicacid），PLGA］纳米纤维与二甲基二硫代氨基甲酸铅薄膜（Leaddi⁃methyldithiocarbamate，LMD）偶联来筛选CTCs［17⁃18］。分离的肿瘤细胞可用来监测肿瘤的进展情况和肿瘤的治疗效果，而分离的单个肿瘤细胞可以用来做下游的基因分型和测序，相比于其他类型的肿瘤活检方式，这种肿瘤的液体活检方式更方便简洁。第3代是温度敏感性的SiNS芯片，可以在37℃条件下捕获CTCs，而在4℃条件下可以释放出捕获的CTCs，这种利用不同温度下SiNS构象的改变来捕获和分离CTCs的特性能更加有效地保持肿瘤细胞的完整性和生物学特性［6，16，19］。除了硅纳米结构基质NanoVelcro芯片，后续的其他很多研究也发现了许多其他的材料，诸如聚（3，4⁃乙烯二氧噻吩）［Poly（3，4⁃ethylene⁃dioxythiophene），PEDOT］来源的NanoVelcro芯片、四氧化三铁纳米芯片等，可能具有更好地分离CTCs的性能［2，20］。纳米的磁性材料或是非磁性的纳米免疫富集方法均可增加分离CTCs时的接触面积，从而增加捕获CTCs的效率。1.2核酸适配体（Aptamer）技术Aptamer技术本质上是一种改进的NanoVel⁃crocell⁃affinitysubstratesCTC芯片，传统SiNS基板上结合的EpCAM抗体能够帮助更好地捕获CTCs，新的核酸适配体（Aptamer）技术则是在SiNS基板上连接链霉亲和素及其生物素化的配体，这种基板上的适配体可以有效地识别CTCs细胞膜外表面上的配体，从而达到固定和富集血液中CTCs的目的，而固定的CTCs可在酶的作用下与适配体解离释放，从而达到可控性分离和富集CTCs的作用。这种方法可以减少昂贵的EpCAM抗体的使用，同时也是一种高效的富集CTCs的手段［2，16］。1.3CellSearch系统该系统是目前唯一被FDA批准用于转移性乳腺癌、结直肠癌和前列腺CTCs检测的技术，该系统可集免疫磁珠富集技术和免疫荧光技术于一体，主要依靠外面包被了特异EpCAM抗体的免疫纳米磁珠与血液中表达EpCAM的CTCs结合来分··2分子诊断与治疗杂志2017年1月第9卷第1期JMolDiagnTher,January2017,Vol.9No.1选CTCs，并进一步通过荧光反应识别CTCs，分选效率高，研究表明利用免疫磁珠分离方法可明显增加外周血肿瘤细胞的检出率［21⁃25］。CellSearch系统能够实现CTCs的半自动化检测并且具有较高的敏感性、特异性、准确性和可重复性。但Cell⁃Search每次检测需要7.5mL血液，所消耗的Ep⁃CAM抗体昂贵，且无法捕获不表达EpCAM的细胞或因发生上皮间质转换导致细胞EpCAM表位丢失的细胞，分离后的细胞可能会因为磁珠无法与细胞完全分离干净而导致细胞完整性和活性受到破坏，导致捕获细胞的再利用受到一定影响。同时，新的研究发现MagSweeper，IsoFlux，VerIFAST系统可能具有更高的富集CTCs的效果［26⁃28］，麻省总医院（MassachusettsGeneralHospi⁃tal，MGH）的研究团队也发现负向的间接分选机制也有不错的分离效果［29］。1.4微流控芯片技术微流控芯片技术是指根据实际需求，在一些高分子聚合材料上（如PDMS）制作出各种结构尺寸的微米量级管道，血液流体在微流控的微通道中的行为与其在宏观尺度通道中不同，微流控通道可以实现一系列常规方法所难以完成的微加工和微操作。微流控芯片管道可依据细胞大小来设计，微流控芯片分选和富集CTCs也会利用循环肿瘤细胞表达的EpCAM与EpCAM抗体特异性结合来分选CTCs，通过抗原抗体结合抓捕到的CTCs可使用胰蛋白酶使其释放，也可利用细胞的大小、免疫磁珠连同抗体的特异性结合来分离