第15章-流式细胞仪教学指导

1第十五章流式细胞仪首页基本要求重点难点讲授学时内容提要1．基本要求1.1了解(1)流式细胞仪的发展史(2)流式细胞仪测量数据的存贮、显示与分析1.2熟悉(1)流式细胞仪的主要性能指标有哪些?这些指标的作用、测量方法和影响因素是什么?(2)流式细胞仪操作技术的质量控制主要涉及那几个方面？(3)流式细胞仪出现故障及排除方法是什么?(4)流式细胞仪主要应用哪些领域？1.3掌握(1)什么是流式细胞技术和流式细胞仪？(2)流式细胞仪的工作原理是什么？(3)简述流式细胞仪的基本结构？(4)流式细胞仪的液流系统由哪几部分组成？(5)流式细胞仪的流动室通常由什么材料制成？(6)流式细胞仪的光源有什么特点？(7)流式细胞仪的光学系统组成和各种滤光片的作用是什么?(8)流式细胞仪所检测的信号有哪些？(9)流式细胞仪信号所代表的意义、作用、测量方式和校正方法是什么？(10)流式细胞仪分选器的组成、细胞分选原理和影响因素是什么？2．重点难点2.1重点(1)流式细胞仪和流式细胞技术的基本概念(2)流式细胞仪的工作原理(3)流式细胞仪的基本结构(4)流式细胞仪所检测的信号有哪些？2(5)流式细胞仪信号所代表的意义、作用、测量方式和校正方法是什么？(6)流式细胞仪分选器的组成、细胞分选原理和影响因素2.2难点(1)流式细胞仪信号所代表的意义、作用、测量方式和校正方法是什么？(2)流式细胞仪分选器的组成、细胞分选原理和影响因素(3)流式细胞仪的主要性能指标有哪些?这些指标的作用、测量方法和影响因素是什么?3．讲授学时建议6学时～8学时4．内容提要4.1流式细胞仪基本原理生物学颗粒分析原理①流式细胞技术是在单细胞水平上，对于处在快速直线流动状态中的大量细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术，现已成为现代医学研究最先进的分析技术之一。应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的技术称为流式细胞术。②生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细菌、霉菌、染色体、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等，所检测的生物颗粒的理化性质包括细胞大小、细胞形态、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白质含量、细胞膜完整性和酶活性等。③流式细胞仪是以激光为光源，集流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。④流式细胞仪是在荧光显微镜技术、血细胞计数仪和喷墨技术的基础上发展起来的。⑤鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，与水平方向的激光束垂直相交，染色的细胞受激光照射后发出荧光，这些信号分别被光电倍增管荧光检测器和光电二极管散射光检测器接收，经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得到细胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物理和生化指标。流式细胞仪细胞分选原理在压电晶体上加上频率为30kHz的信号，使液柱断裂成一连串均匀的液滴。当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内，从而达到细胞分类收集的目的。34.2流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构可分为流动室及液流驱动系统；激光光源及光束成形系统；光学系统；信号检测与分析系统；细胞分选系统等五个部分。流式细胞仪流动室与液流驱动系统流动室是FCM的核心部件，被测样品在此与激光束相交。流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。流式细胞仪激光光源与光束成形系统激光是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。激光光束在到达流动室前，先经过透镜将其聚焦，形成几何尺寸约为22μm×66μm即短轴稍大于细胞直径的光斑。流式细胞仪光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入不同的电子探测器。作为FCM光学系统中的主要光学元件的滤光片，主要分为长通滤片、短通滤片和带通滤片三类。①长通滤光片②短通滤光片4③带通滤光片流式细胞仪信号检测与分析（1）散射光信号散射光分为前向角散射和侧向角散射，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，称为细胞的物理参数Ⅰ前向角散射前向角散射与被测细胞的大小有关，确切地说与细胞直径的平方密切相关。Ⅱ侧向角散射侧向角散射是指与激光束正交900方向的散射光信号。侧向散射光对细胞膜、细胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供细胞内精细结构和颗粒性质的信息。（2）荧光信号当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析能了解所研究细胞的存在和定量。Ⅰ荧光信号线性测量和对数测量：Ⅱ荧光信号的面积和宽度Ⅲ光谱重叠的校正从下图可以看出，阴影为探测器检测光谱的范围，FITC探测器会探测到少量的PE光谱，而PE探测器则检测到较多的FITC光谱。克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路，利用已知标准样品或荧光小珠，可合理设置荧光信号的补偿值。下图中点A通过透镜f成像在A’处，而点B通过透镜f成像在B’处。在光电倍增管前放上一小孔，作为空间滤波器，排除其它杂散光信号，从而确保了A点光源进不了B’点处，B点光源也进不了A’点处。因此，避免第一激光(488nm)激发出的FL1，FL2，FL3和第二激光(635nm)激发出的FL4间的补偿。当然FL1，FL2和FL3是来自于同一点光源，它们之间的补偿是不可避免的。5流式细胞仪细胞分选器细胞分选器由水滴形成、充电及偏转三部分组成。（1）水滴的形成安装在流动室上的压电晶体加有数万赫兹的电信号，于是压电晶体带动流动室一起振动。液流从喷孔出来后，需要经过一段距离才被破坏形成水滴。（2）水滴的充电给水滴充电的脉冲并不是在做出分选决定时立即产生并加到流束上的，而是当细胞达到分离点时才加上的。（3）水滴的偏转当水滴从流束上将要断开时给整个流束充电，则水滴从流束上断开后便带有同极性的多余表面电荷，在电场中偏向与其有相反电荷的电极板而被分选。4.3流式细胞仪的主要性能指标①灵敏度灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标。一般以能检测到单个微球上最少标有FITC或PE荧光分子数目来表示，现在的FCM均可达到检测小于100个荧光分子的指标。前向角散射光检测灵敏度是指能够检测到的最小颗粒大小，一般目前商品化的FCM可以测量到0.2μm～0.5μm左右。②仪器的分辨率分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV(CoefficientofVariation)值表示。③分析速度一般可达到3000个/秒～6000个/秒左右，大型机已达到每秒几万个细胞。④分选指标分选指标主要包括分选速度、分选纯度和分选收获率。4.4流式细胞仪应用的技术要求①检测样品制备的重要性如果两个或多个细胞间粘连重叠或细胞碎片过多，都会影响信号的收集及所收集信号的真实性，6所以制备单细胞悬液是进行流式细胞仪分析最关键的第一步。②免疫分析中常用的荧光染料与标记染色荧光信号来自于细胞的自发荧光或被分析细胞经特异性荧光标记染色后通过激光束激发后所产生的。因此，被分析细胞在制备成单细胞悬液后，经过与荧光染料染色后才能上机进行检测。③流式细胞仪操作技术的质量控制光路与流路校正CV值越小，则仪器工作状态精度越高。CV值一般在2％～3％左右，不超过5％～10％。PMT校准对光电倍增管的校正是流式细胞仪在使用前进行的一项重要质控指标。绝对计数的校准在进行免疫学检测时，常需对测定细胞进行绝对计数。4.5流式细胞仪的维护①使用FCM的注意事项②常见故障及排除4.6流式细胞仪的临床应用①流式细胞仪在免疫学中的应用②流式细胞仪在血液学中的应用③流式细胞仪在细胞生物学中的应用④流式细胞仪在肿瘤学中的应用⑤流式细胞仪在AIDS病检测中的分析⑥流式细胞仪对自身免疫性疾病相关HLA抗原的分析⑦流式细胞仪在药物学方面的应用