ERCC1mRNA表达水平基因检测标准操作规程

长沙三济个体化用药基因扩增检验室标准操作规程文件文件号：YLPCR-SOP-24版号/修订号：1/0页号：第1页总页数：共6页文件名：ERCC1mRNA表达水平基因检测（荧光定量PCR）标准操作规程日期：201108081.目的：规范ERCC1mRNA表达水平检测（荧光定量PCR）操作流程，保证检测结果准确性。2.项目名称：ERCC1mRNA表达水平检测。检测方法：荧光PCR。3.方法原理：PCR方法结合荧光探针的体外扩增和检测技术。4.仪器：博日荧光定量PCR扩增仪。5.操作步骤：5.1样本RNA提取(样本室)5.1.1根据《临床标本采集、验收、拒收标准操作规程》接收合格的临床检测样本（同一患者的正常组织样本和肿瘤组织样本各一份）。5.1.2从试剂盒中取出组织RNA提取需要用到的试剂,室温融化后，2000rpm离心10sec；5.1.3参照《组织样本RNA提取标准操作规程》提取正常组织样本和肿瘤组织样本的RNA。5.1.4提取的RNA样本需要在24小时内进行逆转录操作，否则需置于-80℃保存。5.1.5RNA提取后剩余的组织样本置于-80℃保存，备查。5.2样本RNA的逆转录5.2.1取出ERCC1-RT-PCR反应液和引物，按要求稀释溶解引物，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec。5.2.2参考根据《RNA逆转录标准操作规程》设计针对ERCC1基因的RT-PCR扩增。5.2.3根据RNA样本数，确定RT-PCR扩增反应管数，按5.2.4表计算反应混合液的用量，分装入每个PCR反应管中，振荡混匀，2000rpm离心10sec后，49μl/管；注意避免产生气泡，盖好管盖后经传递仓转移至样本处理区。（试剂准备室）5.2.4单管RT-PCR反应液配制（50ul体系）：2×mRNASelectivePCRBuffer25ulMgCl210uldNTPs/analogMixture5ulRNA酶抑制剂1ul逆转录酶1ulDNA聚合酶1ul上游引物F1ul长沙三济个体化用药基因扩增检验室标准操作规程文件文件号：YLPCR-SOP-24版号/修订号：1/0页号：第1页总页数：共6页文件名：ERCC1mRNA表达水平基因检测（荧光定量PCR）标准操作规程日期：20110808下游引物R1ulddH2O4ul样本1ul5.2.5加样（样本处理室）5.2.5.1PCR反应管中分别加入不同样本提取的DNA模板各1μl（在生物安全柜中进行操作）；5.2.5.2应将样本直接加入反应液内，避免样本粘附在管壁上，盖紧管盖充分混匀后低速离心10sec，转移至扩增区。5.2.6RT-PCR扩增反应(扩增室)5.2.6.1将反应管排好放入PCR扩增仪内，记录样本摆放顺序；5.2.6.2反应循环条件设置（参照《博日PCR仪使用、维护、校准标准操作规程》）：50℃15min1cycle85℃1min45℃1min25cycle72℃1min反应体系为50µl。5.2.7反应结束后，取RT-PCR反应液（5～10ul）进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物为目标DNA片段，-20℃保存。5.3荧光定量实验5.3.1扩增试剂准备（试剂准备室）5.3.1.1从试剂盒中取出ERCC1荧光定量PCR反应液、Taq酶、引物、探针，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec；5.3.1.2确定检测反应管数为n（n＝样本数＋4管不同浓度梯度的标准品＋阴性对照）按5.3.1.3表计算反应体系(40ul)各试剂的用量，加入一适当体积离心管，充分混匀，2000rpm离心10sec后分装入每个PCR反应管中，38μl/管；注意避免产生气泡，盖好管盖后转移至样本处理室。5.3.1.3单个检测反应体系配制表：ddH2O27.2ulPCRbuffer4uldNTPs4ulPrimerF0.8ulPrimerR0.8ul长沙三济个体化用药基因扩增检验室标准操作规程文件文件号：YLPCR-SOP-24版号/修订号：1/0页号：第1页总页数：共6页文件名：ERCC1mRNA表达水平基因检测（荧光定量PCR）标准操作规程日期：20110808特异性探针0.8ulTaq酶0.4ul模板2ul5.3.2加样（样本处理室）5.3.2.1将样本RNA逆转录产物从-20℃取出，置室温解冻，2000rpm离心10sec；5.3.2.2在PCR反应管中分别加入正常样本RNA逆转录产物、病变样本RNA逆转录产物及试剂盒中不同浓度梯度的标准品2μl；阴性对照管中加入2ul灭菌超纯水。5.3.2.3应将样本直接加入反应液内，避免样本粘附在管壁上，盖紧管盖充分混匀后低速离心10sec，转移至扩增区。5.3.3PCR扩增（扩增室）5.3.3.1将PCR反应管排好放入博日荧光定量PCR仪内，记录样本摆放顺序。5.3.3.2设置PCR反应参数（参照《博日荧光定量PCR仪》）：循环条件设置：95℃：10min；95℃：10sec；60℃：40sec；（40个循环）。反应体系为40μl。仪器检测通道选择：荧光信号收集：Fam荧光素；收集温度：60℃。（应确严格保同一患者的正常样本与病变样本的扩增条件一致）5.3.3.3将实验结果保存在设定的结果保存盘中。5.3.3.4扩增反应结束后，立即取出反应管，密封在专用塑料袋中，丢弃到废物处理室，统一按照医疗废物处理条例处理。6.结果分析条件设定：6.1打开博日荧光定量PCR仪的结果分析软件，导入保存的实验数据。6.2使用样点拟合法，进行结果分析，构建标准品的标准曲线。6.3进行结果分析时基线的确定：取3—10或3—15个循环的荧光信号。阈值可根据仪器噪音容限来调整。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准；6.4避免漏检强阳性样本，应首先将基线定为3—10个循环荧光信号观察分析Ct值，如果没有Ct值＜16.0的样本，则将基线改定为3—15个循环的荧光信号进行结果分析。长沙三济个体化用药基因扩增检验室标准操作规程文件文件号：3GPCR-SOP-025版号/修订号：1/0页号：第6页总页数：共6页文件名：ERCC1mRNA表达水平检测（荧光定量PCR）标准操作规程日期：20110705荧光曲线标准曲线7.质控标准：7.1阴性对照的检测结果应为阴性；7.2空白对照的Ct值应等于40.0；否则，此次实验视为无效。7.3标准曲线的相关系数大于0.99；否则，此次试验视为无效。8.结果判断：8.1根据标准品构建的标准曲线，并根据样本的Ct值计算出样本的底物浓度。8.2比较标准曲线上计算出正常样本与病变样本的底物浓度，可以判断患者病变组织样本中的mRNA表达水平。比较结果ERCC1mRNA表达水平正常样本浓度低于病变样本浓度病变组织mRNA为高水平表达正常样本浓度高于病变样本浓度病变组织mRNA为低水平表达9.临床意义：临床诊断发现，病变组织ERCC1mRNA为高水平表达的患者使用铂类抗癌药物疗效不如ERCC1mRNA为低水平表达的患者，并且容易产生严重的不良反应；故检测ERCC1mRNA表达水平能够为临床治疗当中铂类药物使用提供个体化用药的依据。