沙门菌检查法

沙门菌检查法1简述沙门菌属是肠杆菌科的重要致病菌，按Bergey系统细菌学手册第一卷（1984），沙门菌分5个亚属。2003年出版的第八版的临床微生物手册将沙门菌属分成两个菌种即肠炎沙门菌和乍得沙门菌，其中肠炎沙门菌分6个亚种，包括常见的伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒、丙型副伤寒、，鼠伤寒，猪霍乱等沙门菌杂内，迄今已发现2501个血清型。O抗原抗血清A-E群包含了沙门菌分离株的95%，所以常用沙门菌A-FO多价血清进行沙门菌初筛试验。药品中的沙门菌，是以鉴定沙门菌属为准，即对没10g（或10ml）药品中是否检出沙门菌作出检验报告。由于沙门菌血清型繁多，各血清型的生化及血清学特性虽密切相关，却不尽相同，采用一种增菌培养基和两种分离培养基，不可能涵盖所有沙门菌的最适增菌及分离条件。此外，由于药品在生产过程中，常受到加热、干燥等加工步骤的影响，药品中污染的沙门菌可受到损伤或呈休眠状态，故须在增菌培养前先进行预增菌。然后再进行增菌及分离、三糖铁琼脂初步鉴别、生化试验、血清学试验等步骤。2仪器、设备及用具（见大肠埃希菌2）。3试液指示液（参见大肠埃希菌3）3.1无菌脲试液[附录2.5]。3.2酚磺酞指示液[附录4.4]。3.3亮绿试液[附录2.9]。3.4氰化钾试液[附录2.14]。3.5溴甲酚紫指示液[附录4.5]。3.6革兰染色液[附录2.4，2.10，2.16]。3.7沙门菌属A-F“O”多价血清（即O多价1）生物制品研究所供应。4培养基4.1营养琼脂培养基[附录5.2]。4.2营养肉汤培养基[附录5.1]。4.3半固体营养琼脂培养基[附录5.3]。4.4曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）[附录5.8]。4.5麦康凯琼脂培养基（MacC）[附录5.9]。4.6四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB）[附录5.11]。4.7三糖铁琼脂培养基（TSI）[附录5.10]。4.8胆盐硫乳琼脂培养基（DHL）[附录5.13]。4.9沙门菌属志贺菌属琼脂培养基（SS）[附录5.12]。4.10蛋白胨水培养基[附录5.18]。4.11脲（尿素）琼脂培养基[附录5.23]。4.12氰化钾培养基[附录5.24]。4.13赖氨酸脱羧酶培养基[附录5.25]。5对照用菌液取乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）50094]是营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，36℃±1℃培养18～24h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1:106（浓度相当于50～100cfu/0.1ml），作阳性对照用菌液。其菌液浓度可用平板菌落计数法测得。即取0.1ml加入平皿内，倾注营养琼脂，混匀，或以0.1ml均匀涂布于事先准备好的营养琼脂平板上，经培养后点计求得。6操作方法6.1准备工作：（见细菌、霉菌和酵母菌计数6）。6.2供试液的制备：（见细菌、霉菌和酵母菌计数7）。含抑菌成分供试品供试液的制备：（见大肠埃希菌6.2）。6.3阳性对照实验、阴性对照实验（见大肠埃希菌7.1）。6.4增菌培养6.4.1预增菌取营养肉汤培养基2份，每份200ml，1份加入10g或者10ml供试品使匀，另1份加入稀释剂10ml作阴性对照，36℃±1℃培养18～24h，观察。摇动阴性对照瓶后应清亮透明，无菌生长。6.4.2增菌培养轻微摇动供试品增菌培养瓶，吸取1ml接种于1管含10ml四硫磺酸钠亮绿培养基的试管中，培养18～24h。6.5分离培养轻微摇动供试品增菌培养，以接种环沾取1～2环培养液划线于胆盐硫乳琼脂（DHL）或沙门菌志贺菌琼脂（SS）平板及曙红亚甲蓝（EMB）琼脂或麦康凯琼脂平板各1个，倒置培养24～48h。检查平板上有无疑似沙门菌菌落。沙门菌在上述平板上的菌落形态特征见表1。表1沙门菌的菌落特征平板菌落形态胆盐硫乳琼脂（DHL）无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色沙门菌属志贺菌属琼脂（SS）无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色曙红亚甲蓝琼脂（EMB）无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落麦康凯琼脂（MacC）无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色由于沙门菌不发酵乳糖和蔗糖，不产酸，菌落不着色，一般为无色半透明，多数沙门菌因产生H2S，菌落中心呈现黑色甚至全黑色，在DHL琼脂平板上较为明显。在SS琼脂平板上，H2S特征有时不明显，沙门菌属亚属Ⅲ因多数菌株发酵乳糖，故在上述平板上的乳糖发酵菌落呈现粉红或紫色，但由于产生H2S，在有H2S指示系统的平板上仍出现黑色中心。在上述培养基上，有些非沙门菌属细菌，也可呈现类似沙门菌菌落形态，须进一步鉴别。由于药物的影响或非典型菌株的存在，沙门菌菌落可呈现非典型形态，如色泽变深，菌落粗糙等，应注意辨别。6.6初步鉴别试验从每个供试品的分离平板上挑取2～3个疑似菌落（菌落形态特征与表1所列的形态特征相符或疑似）分别接种于三糖铁琼脂斜面，接种时应以接种针轻轻接触单个菌落中心部位，沾取培养物划线于三糖铁琼脂斜面并穿刺到底层或先穿刺底层再划线斜面，培养18～24h，观察结果。疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反应为：①斜面红色（产碱），底层黑色（产H2S）并显示黄色（产酸）；②斜面红色，底层黄色；③斜面黄色，底层黑色，并显示黄色。多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体，使底层琼脂出现气泡或使琼脂断裂，但也有不产生气体的菌种。对在三糖铁琼脂斜面黄色并同时底层无黑色，或斜面及底层均为红色者可以排除沙门菌。将疑似沙门菌的三糖铁琼脂或营养琼脂斜面培养物作生化试验，血清凝集试验及革兰染色，镜检。沙门菌应为革兰性杆菌。6.7生化试验6.7.1靛基质试验用接种环沾取少许培养物，接种到蛋白胨水培养基中，照大肠埃希菌靛基质试验项下操作、判断结果。沙门菌应为阴性反应。6.7.2脲酶试验用接种环沾取少许培养物，划线接种于脲琼脂斜面，培养24h，观察结果。斜面变为红色为阳性反应，沙门菌属为阴性反应。6.7.3氰化钾试验竟培养物先接种至营养肉汤培养基中培养20～24h，用接种环沾取培养液1环，接种至氰化钾培养基内，另取一环培养液接种于不含氰化钾的同样培养基内作对照管，接种后即以橡胶塞塞紧，培养24～48h，观察结果。对照管内有菌生长（浑浊），而试验管也有菌生长为阳性反应；对照管有菌生长（浑浊）而试验管无菌生长（清亮）为阴性反应。沙门菌应为阴性反应。本试验应十分注意密封管口，夏天分装培养基宜在冰浴中进行，防止氯化钾分解，产生氢氰酸逸出，致使培养基内氰化钾浓度降低，不能抑制细菌生长，造成假阳性。氰化钾为剧毒品、操作时须谨慎，切勿用口吸液。用后的培养基，每管加数粒硫酸亚铁和20%氢氧化钾0.5ml，去毒，然后再灭菌，洗涤。6.7.4赖氨酸脱羧酶试验用接种环沾取少许培养物，接种在赖氨酸脱羧酶培养基中，同时接种一支不含赖氨酸的同样培养基作为对照管，培养24～48h观察结果。对照管黄色（产酸），试验管呈紫色为阳性反应（赖氨酸脱羧酶产碱）；试验管黄色为阴性反应。沙门菌应为阳性反应。6.7.5动力试验用接种针沾取培养物，穿刺接种于半固体营养琼脂管中，培养24h，观察结果。有动力的细菌能在穿刺线以外的培养基内扩散生长使培养基呈浑浊现象；无动力的细菌仅能沿穿刺线生长，不向外扩散，培养基仍呈清晰透明状；无动力表现的培养物，应在室温保留2～3天后，再行观察。沙门菌除鸡雏沙门菌及无动力的变种外，均具有周身鞭毛，能运动，动力试验阳性。沙门菌生化反应的初步鉴别见表2表2沙门菌与有关细菌在三糖铁琼脂及初步生化试验的鉴别序三糖铁琼脂靛基脲酶氰化赖氨酸脱判定菌属斜面产层产气硫化号氢质钾羧酶1.1－＋＋/－＋/－－－－＋沙门菌属1.2＋/－＋＋＋－－－＋沙门菌属Ⅲ2－＋＋/－＋＋－－＋缓慢爱德华菌属3＋/－＋＋/－＋/－－/＋－/＋＋/－－弗劳地柠檬酸杆菌4.1－＋＋S＋－＋＋－奇异变形杆菌4.2－＋＋/－S＋＋＋＋－普通变形杆菌5＋/－＋＋/－－＋/－－－＋/－大肠埃希杆菌6－＋－－－/＋－－－志贺菌属7.1＋＋＋－－＋/＋－阴沟肠杆菌－7.2＋＋＋－－＋/－＋＋肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌8－＋＋S/－－＋＋/－＋－普罗菲登斯菌属、摩根菌属9－＋＋/－－－－/＋＋＋蜂房哈夫尼亚菌、粘质沙雷菌注：＋产酸（黄色），阳性，阳性率90%；－产碱（红色），阴性，阴性率90%；＋／－多数阳性、少数阴性；＋S产生少量气体（本表依据何晓青卫生防疫细菌检验参考第八版美国临床微生物手册）；反应序号１.１不产H2S可结合血清学凝集试验，或加做部分生化试验，判定为沙门菌；反应序号１除典型反应外，脲酶、氰化钾试验、赖氨酸脱羧酶试验三项中有一项异常；反应序号２仅靛基质阳性。其他情况可排除沙门菌。6.8血清学凝集试验6.8.1准备1片洁净的灭菌载玻片，在近中央的一端，以直径3mm接种环沾取沙门菌属Ｏ多价1血清2～3环制成与玻片横径相垂直的条形涂抹，长约1.5cm，宽约0.5cm。另一端用生理盐水代替血清同法操作，作为阴性对照。6.8.2用接种环分别挑取三糖铁琼脂斜面或营养琼脂斜面的新鲜培养物少许，在血清和盐水中混匀。菌量要适当，勿过浓。6.8.3将玻片前后倾斜数次，以暗色背景衬底，在良好的照明条件下进行观察，阴性对照不出现凝集现象都是阳性反应。阳性反应通常在3min内发生。有时因血清效价低、反应迟缓时，应将玻片置培养皿内，并放一个湿棉球在旁边，盖上皿盖，经约20min，再观察结果。如果仍然没有出现凝聚，应取斜面培养物，置含少量生理盐水的试管中，制成浓菌悬液，在100℃水浴中保温30min，以除去可能存在的Vi抗原，待冷，再做凝集试验，如出现凝集，仍判为阳性反应；如不出现凝集现象，则为阴性反应。6.8.4如对照试验出现凝集现象为非特异反应，须对该菌株培养物进行处理后再作凝集试验。7结果判定7.1供试品培养物为革兰阴性杆菌，三糖铁琼脂反应及生化反应符合沙门菌属反应。多价1血清凝集试验阳性反应（含待检培养物经100℃30min处理后凝集试验为阳性反应），报告10g或10ml供试品检出沙门菌。7.2供试品培养物三糖铁琼脂反应或生化反应不符合沙门菌属反应。多价1血清凝集试验为阴性反应（含待检培养物经100℃30min处理后凝集试验为阴性反应），报告10g或10ml供试品未检出沙门菌。7.3供试品培养物出现下列情况，应继续鉴定或保留菌种，送交有关单位进一不鉴定后，再作报告。7.3.1供试品培养物的生化反应符合沙门菌属反应多价1血清凝集试验阴性反应。7.3.2供试品培养物的生化反应不符合沙门菌属反应多价1血清凝集反应呈阳性反应。7.4对已检出沙门菌的供试品分离的菌种，有条件者，应进一步作菌型鉴定。根据检出菌的特性，推断可能菌型，增加生化试验项目及沙门菌单因子血清“O”及“H”进行鉴定。8注意事项8.1试验用培养基，需经过质量鉴定，用已知典型反应菌株（如乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）50094]进行测试，其灵敏度及特征性反应应符合要求。培养基需在规定条件保存，在规定时间内使用。分离平板在使用应置36℃温箱内倒置孵育1～2h，使其表面温暖湿润，利于分离。8.2在对供试品进行测试的同时，需做阳性菌对照及阴性对照。阴性对照应无菌生长，阳性对照应显示阳性结果，否则检验结果无效。特别是用接种环沾取菌液进行接种或分离时，避免动作过大，形成气溶胶，污染操作环境。8.3为保证试验方法发可靠性，对分离平板上的疑似菌落，应多选取几个菌落同时进行试验。挑取菌落时，不要在分离平板菌落密集部位挑取可疑菌落，而应在菌落分布稀疏部位挑选。8.4生化试验及血清学试验的被鉴定培养物必须是纯培养物，否则，不可能得到正确结果。如遇血清学凝集试验阳性而生化试验不符合时，应首先检查培养物的纯度。对已污染的培养物，不应丢弃，因为污染菌可能掩盖沙门菌，故应对被污染的培养物重新分离，仔细选取单个菌落再进行试验。8.5所有生化反应均需按照规定的试验要求进行，如观察三糖铁琼脂斜面反应的时间，应在24±2h，时间过短过长，都可能出现错误的结果判断。又如氰化钾试验，试管口应密塞，否则氰化钾浓度降低，致使抑菌作用下降。8.6血清凝集试验的影响因素甚多，除与电解质、