全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪

第十八章全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪◄■⊃►◈前言了解生命现象、解释疾病的发生、诊断和治疗疾病，是生命科学的核心内容之一核酸和蛋白质是控制生命过程的两种重要大分子，其结构或功能异常是导致遗传性疾病或遗传相关性疾病的主要因素或相关因素，是生命科学研究的主要对象◄■⊃►◈前言核酸分子携带生命活动的全套信息，其基本结构―核苷酸的线性排列构成它的一级结构蛋白质的一级结构是指构成蛋白质的基本单位－氨基酸的排列顺序，研究蛋白质的一级结构是了解蛋白质功能的基础◄■⊃►◈本章内容提要第一节全自动DNA测序仪一、工作原理（一）双脱氧链末端终止法测序原理（二）新生链的荧光标记原理（三）荧光标记DNA的检测原理二、全自动DNA测序仪的结构与功能（一）仪器的组成（二）仪器各组成部分的功能三、全自动DNA测序仪的常见故障及维护（一）毛细管电泳型DNA测序仪的常见故障及维护（二）平板电泳型DNA测序仪的常见故障及维护四、全自动DNA测序仪的进展五、全自动DNA测序仪的主要应用第二节蛋白质自动测序仪一、蛋白质测序仪的工作原理二、蛋白质测序仪的结构及其各部件的功能三、蛋白质测序仪的主要应用本章小结◄■⊃►◈第一节全自动DNA测序仪DNA测序核苷酸序列早期：小片段重叠法通过测定RNA序列来推测DNA序列缺点：既费时又不准确20世纪80年代以后：DNA自动测序仪Sanger双脱氧链末端终止法Maxam-Gilber化学降解法优点：操作简单、安全、快速、准确◄■⊃►◈一、全自动DNA测序仪工作原理Sanger双脱氧链末端终止法Maxam-Gilber化学降解法都是根据在某一固定的点开始核苷酸链的延伸，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷酸链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片段的分离和检测，从而获得DNA序列双脱氧链末端终止法更简便和更适合于光学自动探测，故在全自动DNA测序仪中应用广泛◄■⊃►◈（一）双脱氧链末端终止法测序原理利用DNA的体外合成过程－－聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）DNA聚合酶的催化以目的DNA为模板按照碱基互补配对原则在引物的引导下单核苷酸聚合形成新DNA链◄■⊃►◈（一）双脱氧链末端终止法测序原理•普通的PCR反应体系中，加入的核苷酸单体为4种2’-脱氧核苷三磷酸（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）图18-1dNTP结构示意图◄■⊃►◈（一）双脱氧链末端终止法测序原理•测序反应体系中，加入的核苷酸单体为2’,3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）图18-2ddNTP结构示意图◄■⊃►◈（一）双脱氧链末端终止法测序原理与dNTP相比，ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少一个羟基，反应过程中虽然可以在DNA聚合酶作用下，通过其磷酸基团与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖-OH发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中，但它们本身没有-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此终止。◄■⊃►◈（一）双脱氧链末端终止法测序原理据此原理分别设计四个反应体系，每一反应体系中存在相同的DNA模板、引物、四种dNTP和一种ddNTP(如ddATP)，则新合成的DNA链在可能掺入正常dNTP的位置都有可能掺入ddNTP而导致新合成链在不同的位置终止。由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。◄■⊃►◈ATemplatePrimerdNTPsPolymeraseTerminatorGCT（一）双脱氧链末端终止法测序原理图18-3双脱氧链末端终止法测序反应原理（1）◄■⊃►◈（一）双脱氧链末端终止法测序原理TCGACGTCGACGTCGACGTTAAACTGGCCTAATCGAGTCAGTTGACCGGATTT图18-4双脱氧链末端终止法测序反应原理（2）◄■⊃►◈T（一）双脱氧链末端终止法测序原理图18-5双脱氧链末端终止法测序反应原理（3）◄■⊃►◈A（一）双脱氧链末端终止法测序原理CG图18-6双脱氧链末端终止法测序反应原理（4）◄■⊃►◈（一）双脱氧链末端终止法测序原理图18-7双脱氧链末端终止法测序反应原理（5）◄■⊃►◈（二）新生链的荧光标记原理早期采用同位素法标记新生链，因其具有放射性危害、背景高等缺点而很快被荧光染料标记法所取代荧光染料的荧光和散射背景较弱，提高了信噪比；它们的激发光谱较接近而发射光谱均位于可见光范围，且不同染料的发射光谱相互分开，易于监测，故在DNA自动测序中得到广泛应用◄■⊃►◈（二）新生链的荧光标记原理•荧光染料标记法单色荧光标记法多色荧光标记法荧光标记引物法荧光标记终止底物法荧光标记引物法荧光标记终止底物法◄■⊃►◈（二）新生链的荧光标记原理多色荧光标记法--荧光标记引物法定义：将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5’端一组（4种）荧光标记引物，其序列相同，但标记的荧光染料颜色不同测序反应中，模板、反应底物、DNA聚合酶及标记引物等按A、T、C、G编号被置于4支微量离心管中，A、T、C、G四个测序反应分管进行，上样时合并在一个泳道内电泳。特定颜色荧光标记的引物则与特定的双脱氧核苷酸底物保持对应关系5◄■⊃►◈（二）新生链的荧光标记原理•荧光标记引物法CAGTPrimerPrimerPrimerPrimerCAGTCAGTCCAAGGTTPrimerPrimerPrimerPrimerPrimerPrimerPrimerPrimerPrimerPrimerPrimerPrimerPrimerPrimerPrimerPrimer图18-8荧光标记引物法原理◄■⊃►◈（二）新生链的荧光标记原理多色荧光标记法--荧光标记终止底物法定义：将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷酸上反应中将4种ddNTP分别用4种不同的荧光染料标记，带有荧光基团的ddNTP在掺入DNA片段导致链延伸终止的同时，也使该片段端标上了一种特定的荧光染料经电泳后将各个荧光谱带分开，根据荧光颜色的不同来判断所代表的不同碱基信息◄■⊃►◈（二）新生链的荧光标记原理模板：TCCATGAT产物：AAGAGGAGGTAGGTAAGGTACAGGTACTAGCTGGTTAAC图18-9新生链的荧光标记原理◄■⊃►◈（二）新生链的荧光标记原理荧光标记引物法和荧光标记终止底物法的异同点：•都确定了4种荧光染料与4种ddNTP所终止的DNA片段之间的专一对应关系•荧光标记引物法使荧光有色基团标记在长短不同的DNA片段的端，可理解为荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一DNA片段的两端，且标记发生在引物与模板的退火过程中，而终止是发生在片段延伸过程中，两者在时间上有一定间隔•荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为一，两者在同一时间完成•在具体操作中，前者要求A、C、G、T四个反应分别进行，而后者的四种反应可以在同一管中完成◄■⊃►◈（二）新生链的荧光标记原理单色荧光标记法•也包括荧光标记引物法和荧光标记终止底物法•与多色荧光标记法不同的是单色荧光标记引物法和荧光标记终止底物法均需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳◄■⊃►◈（二）新生链的荧光标记原理单色荧光标记法与多色荧光标记法的异同点：•均可分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法•单色荧光标记法需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳•多色荧光标记引物法需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时可合并在同一泳道中电泳•多色荧光标记终止底物法可将A、C、G、T四个反应在同一扩增管中进行，电泳时在同一泳道中电泳◄■⊃►◈（三）荧光标记DNA的检测原理测序反应一般以单引物进行DNA聚合酶延伸反应，绝大多数产物均为单链反应结束后，样品经简单纯化处理就可以放置到自动测序仪中开始电泳两极间极高的电势差推动着各个荧光DNA片段在凝胶高分子聚合物中从负极向正级泳动并达到相互分离，且依次通过检测窗口由激光器发出的极细光束，通过精密的光学系统被导向检测区，在这里激光束以与凝胶垂直的角度激发荧光DNA片段◄■⊃►◈（三）荧光标记DNA的检测原理DNA片段上的荧光发色基团吸收了激光束提供的能量而发射出特征波长的荧光代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射到CCD摄像机上同步成像。收集的荧光信号再传输给计算机加以处理整个电泳过程结束时在检测区某一点上采集的所有荧光信号就转化为一个以时间为横轴坐标，荧光波长种类和强度为纵轴的信号数据的集合经测序分析软件对这些原始数据进行分析，最后的测序结果以一种清晰直观的图形显示出来◄■⊃►◈（三）荧光标记DNA的检测原理多色荧光标记技术检测优点：一个样本的四个测序反应产物可以同时在一个泳道内电泳，避免单一标记时四个泳道测序因泳道间迁移率不同对精确度的影响，提高了测序精度一个样品所有反应产物只需进样一次，所以一次实验便可以处理较之手工方法更多的样品。在相同样品数的情况下，加样的工作量也大大减少◄■⊃►◈二、全自动DNA测序仪的结构与功能全自动DNA测序仪平板型电泳的凝胶灌制在两块玻璃板中间，聚合后厚度一般小于0.4mm或更少，因此又称为超薄片层凝胶电泳毛细管电泳技术将凝胶高分子聚合物灌制于毛细管中（内径50m～100m），在高压及较低浓度胶的条件下实现DNA片段的快速分离平板型电泳毛细管电泳◄■⊃►◈（一）仪器的组成主机：主要包括电泳系统、激光器和荧光检测系统；大致可分为自动进样器区、凝胶块区和检测区等结构功能区微型计算机各种应用软件◄■⊃►◈（一）仪器的组成--PE310基因分析仪图18-10PE310基因分析仪的结构◄■⊃►◈凝胶块区自动进样器区检测区（一）仪器的组成--PE310基因分析仪图18-11PE310基因分析仪的主机分区◄■⊃►◈热板毛细管雷射检测器注射器驱动杆毛细管和电极注射器正极缓冲液泵块自动进样器负极缓冲液图18-12PE310基因分析仪的基本结构◄■⊃►◈（二）仪器各组成部分的功能1.主机功能具有自动灌胶、进样、电泳、荧光检测等功能(1)自动进样器区功能①自动进样器受程序控制进行三维移动，因负极电极和毛细管均固定不动，故许多操作如毛细管进入样品盘标本孔中进样、电极和毛细管在电极缓冲液瓶、洗涤液和废液管中移动等均依靠自动进样器的移动完成；◄■⊃►◈（二）仪器各组成部分的功能②电极为电泳的负性电极，测序过程中，正、负极之间的电势差可达15000伏，如此高的电势差可促进DNA分子在毛细管中很快泳动，达到快速分离不同长度DNA片段的目的；③样品盘有48孔和96孔两种，可一次性连续测试48或96个样本；④电极固定螺母起固定电极及毛细管的作用。◄■⊃►◈（二）仪器各组成部分的功能(2)凝胶块区功能①注射器驱动杆：给注射器提供正压力，将注射器内的凝胶注入毛细管中。在分析每一个样品前，泵自动冲掉上一次分析用过的胶，灌入新胶；②样品盘按钮：控制自动进样器进出；③注射器固定平台：起固定注射器的作用；④电极：为电泳的正性电极，始终浸泡在正极缓冲液中；◄■⊃►◈（二）仪器各组成部分的功能⑤正极缓冲液阀：当注射器驱动杆下移，将注射器内的凝胶压入毛细管时，缓冲液阀关闭，以防止胶进入缓冲液；电泳时此阀打开，提供电流通道；⑥玻璃注射器：储存凝胶高分子聚合物以及在填充毛细管时提供必要的压力；⑦毛细管固定螺母：固定毛细管；⑧废液阀：在清洗泵块时控制废液流。◄■⊃►◈（二）仪器各组成部分的功能(3)检测区功能①激光检测器窗口及窗盖：激光检测器窗口正对毛细管检测窗口，从仪器内部的氩离子激光器发出的激光可通过激光检测器窗口照到毛细管检测窗口上。电泳时，当荧光标记DNA链上的荧光基团通过毛细管窗口时，受到激光的激发而产生特征性的荧光光谱，荧光经分光光栅分光后投射到CCD摄像机上同步成像。窗盖起固定毛细管的作用，同时可防止激光外泄；◄■⊃►◈（二）