华东理工大学发酵过程优化5(复习)

5.发酵过程控制与优化国家生化技术研究中心（上海）发酵的定义狭义的发酵是指在厌氧条件下葡萄糖通过酵解途径生成乳酸或乙醇等的分解代谢过程。广义则将发酵看作是微生物把一些原料养分在合适的发酵条件下经特定的代谢途径转变成所需产物的过程。发酵过程优化发酵是一种很复杂的生化过程，其好坏涉及诸多因素。除了菌种的生产性能，还与培养基的配比，原料的质量，灭菌条件、种子的质量、发酵条件和过程控制等有密切关系。因此，不论是新，老品种，都必需经过发酵研究这一关，以考查其代谢规律、影响产物合成的因素，优化发酵工艺条件。发酵过程优化发酵生产受许多因素的影响和工艺条件的制约，同一生产菌种和培养基配方，不同厂家的生产水平也不一定相同。这是由于各厂家的生产设备，培养基的来源，包括水质和工艺条件各不尽相同。公用系统的成本不同，会采用不同工艺。发酵过程优化通常，菌种的生产性能越高，其生产条件越难满足。高产菌种对工艺条件的波动往往比低产菌种更敏感。掌握生产菌种的代谢规律和发酵调控的基本知识对生产的稳定和提高具有重要的意义。微生物发酵过程培养方式微生物发酵过程可分为分批、补料-分批和半连续(发酵液带放)和连续等几种方式。不同的培养技术各有其优缺点。了解生产菌种在不同工艺条件下的细胞生长、代谢和产物合成的变化规律将有助于发酵生产的控制。分批培养（batch）分批发酵分批发酵是一种准封闭式系统，种子接种到培养基后除了气体流通外发酵液始终留在生物反应器内。在此简单系统内所有液体的流量等于零，故由物料平衡得式5-1－5-3的微分方程：分批发酵•dX/dt=X(5-1)•dS/dt=－qSX(5-2)•dP/dt=qPX(5-3)•式中X为菌体浓度(g/L);t为培养时间(h):为比生长速率（1/h);S为基质浓度(g/L);-qS为比基质消耗速率[(g/g)/h]；P为产物浓度(g/L);qP为比产物形成速率[(g/g)/h]。分批发酵分批发酵过程一般可粗分为4期，即停滞(适应)期、对数(指数)生长期、静止(稳定)期和死亡期；也可细分为六期：即停滞期、加速期、对数期、减速期、静止期和死亡期，如图5-1所示。分批发酵工业生产从发酵产率和发酵指数以及避免染菌考虑，希望尽量缩短适应期。在停滞期(I),即刚接种后的一段时间内，细胞数目和菌量不变，因菌对新的生长环境有一适应过程，其长短主要取决于种子的活性、接种量和培养基的可利用性和浓度。分批发酵加速期(Ⅱ)通常很短，大多数细胞在此期的比生长速率可在短时间内从最小升到最大值。如这时菌已完全适应其周围环境，有充足的养分而又无抑制生长的物质便进入恒定的对数或指数生长期(Ⅲ)分批发酵在对数生长期的比生长速率达最大，可用max表示，指数生长期的长短主要取决于培养基,包括溶氧的可利用性和有害代谢产物的积累。分批发酵在减速期(Ⅳ)随着养分的减少，有害代谢物的积累，生长不可能再无限制地继续。这时比生长速率成为养分、代谢产物和时间的函数，其细胞量仍旧在增加，但其比生长速率不断下降，细胞在代谢与形态方面逐渐蜕化，经短时间的减速后进入生长静止(稳定)期。分批发酵减速期的长短取决于菌对限制性基质的亲和力(Ks值)，亲和力高，即Ks值小，则减速期短。分批发酵静止期(V)，实际上是一种生长和死亡的动态平衡，净生长速率等于零，即＝,式中为比死亡速率。此期菌体的次级代谢十分活跃，许多次级代谢产物在此期大量合成，菌的形态也发生较大的变化，如菌已分化，染色变浅，形成空胞等。分批发酵•当养分耗竭，对生长有害代谢物在发酵液中大量积累便进入死亡期(Ⅵ)。•这时,生长呈负增长。•工业发酵一般不会等到菌体开始自溶时才结束培养。•发酵周期的长短不仅取决于前面五期的长短还取决于Xo。分批发酵将对数期称为生长期(trophophase)。将静止期称为分化期(idiophase)。生长期末为产物的形成创造了必要的条件。分批发酵(1)生长关联型根据产物的形成是否与菌体生长同步关联，Pirt将产物形成动力学分为生长关联型和非生长关联型。一般，初级代谢产物的形成与生长关联；而次级代谢产物的形成与生长非直接关联。分批发酵•qp=Yp/x•对与生长关联的产物形成，比产物形成速率随比生长速率的增长而提高。•这类产物通常是微生物的分解代谢产物，如酒精。•由根霉产生的脂肪酶和由树状黄杆菌产生的葡萄糖异构酶也属于这一类型。分批发酵•(2)非生长关联型此类型的产物形成只与细胞的积累量有关，可用式5-9表示：•dP/dt=X(5-9)•式中dP/dt为产物形成速率[(g/L)/h]；为比例常数。•由此式可见，产物形成速率与菌的生长速率无关，而与菌量有关。次级代谢产物中的一些抗生素的产物合成即属于这一类。分批发酵分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响•在浓度较低的(A~B)范围内，静止期的细胞浓度与初始基质浓度成正比，可用式5-10表达：•X=Y(So－St)(5-10)•式中So为初始基质浓度(g/L);St为经培养时间t的基质浓度(g/L)；Y为得率系数(g细胞/g基质)在A-B的区域，当生长停止时，St等于零。•方程5-10可用于预测用多少初始基质便能得到相应的菌量。分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响•在C-D的区域，菌量不随初始基质浓度的增加而增加。•这时菌的进一步生长受到积累的有害代谢物的限制。分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响•用Monod方程可描述比生长速式中max是最大比生长速率(h-1);Ks为基质利用常数率和残留的限制性基质浓度之间的关系：•＝maxS/(Ks+S)(5-11)•，相当于＝max/2时的基质浓度(g/L),是菌对基质的亲和力的一种度量。分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响•分批培养中后期基质浓度下降，代谢有害物积累，已成为生长限制因素，值下降。•其快慢，取决于菌对限制性基质的亲和力大小。•Ks小，对的影响较小，当St接近0时，急速下降；•Ks大，随St的减小而缓慢下跌，当St接近0时，才迅速下降到零，见图5.4。分批发酵中重要参数的变化分批发酵的优缺点对不同对象，掌握工艺的重点也不同。对产物为细胞本身，可采用能支持最高生长量的培养条件；对产物为初级代谢物，可设法延长与产物关联的对数生长期；对次级代谢物的生产，可缩短对数生长期，延长生产(静止)期，或降低对数期的生长速率，从而使次级代谢物更早形成。分批发酵的优缺点•分批发酵在工业生产上仍有重要地位。采用分批作业有技术和生物上的理由，即操作简单，周期短，染菌的机会减少和生产过程，产品质量易掌握。•分批发酵不适用于测定其过程动力学，因使用复合培养基，不能简单地运用Monod方程来描述生长，存在基质抑制问题，出现二次生长(diauxicgrowth)现象。分批发酵的优缺点如对基质浓度敏感的产物，或次级代谢物，抗生素，用分批发酵不合适，因其周期较短，一般在1－3天，产率较低。由于养分的耗竭，无法维持下去。据此，发展了补料-分批发酵。补料-分批发酵补料(流加)-分批(fed-batch)发酵是在分批发酵过程中补入新鲜料液，以克服由于养分的不足，导致发酵过早结束。由于只有料液的输入，没有输出，因此，发酵液的体积在增加。(除取样外)目前工厂最常用的操作模式。Fed-batch准稳态补料-分批发酵•恒化器的稳态和补料-分批发酵的准稳态的主要区别在于恒化器的是不变的，而补料-分批发酵的是降低的。补料-分批发酵•补料-分批发酵的优点在于它能在这样一种系统中维持很低的基质浓度，从而避免快速利用碳源的阻遏效应和能够按设备的通气能力去维持适当的发酵条件，并且能减缓代谢有害物的不利影响。•减少初始配料体积，有利于消毒时液面控制。比生长速率的最佳策略比生长速率是过程的重要参数之一，表征生物反应器的动态特性。为了获得最大的细胞产量，应在培养期间使μ值最大。为此，应使培养基中的糖浓度保持在一最适范围。如没有现成的在线葡萄糖监控仪，可控制RQ值和乙醇浓度。分批补料的优化为了获得最大的产率,需优化补料的策略。通过一描述比生长速率μ与比生产速率之间的关系的数学模型，藉最大原理(MaximumPrinciple)可容易获得比生长速率的最佳方案。这可以从实际分批-补料培养中改变补料的速率，如边界控制实现。分批补料的优化在分批培养的前期μ应维持在其最大值，μmax,下一阶段μ应保持在μc上。这种控制策略可理解为细胞生长和产物合成的两阶段生产步骤。分批补料的优化基因工程重组干扰素高密度高表达中比生长速率的控制。对重组大肠杆菌W3110(pEC901),当μ0.336h-1,没有乙酸生成，当μ0.336h-1,生成乙酸而且乙酸浓度随着比生长速率增大而增大。分批补料的优化基因工程白蛋白生长相中比生长速率的控制。《重组人血清白蛋白发酵过程生长期的代谢计算》生物工程学报，Vol.16No.5,2000。结合元素平衡和代谢平衡，建立了重组人血清白蛋白发酵过程生长期的数学模型。qgly=-0.05785-1.5184μ可通过控制甘油补料速率来有效控制μ半连续发酵在补料-分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵液(行业中称为带放)便可称为半连续发酵。半连续发酵带放(bleeding)是指放掉的发酵液和其它正常放罐的发酵液一起送去提炼工段。半连续发酵这是考虑到补料-分批发酵虽可通过补料补充养分或前体的不足，但由于有害代谢物的不断积累，产物合成最终难免受到阻遏。放掉部分发酵液，再补入适当料液不仅补充养分和前体而且代谢有害物被稀释，从而有利于产物的继续合成。半连续发酵应用青霉素常用带放操作，实际上也同时将比生长速率控制在合适的数值。μ=0.012h-1使放罐体积往往大于发酵罐体积。半连续发酵的不足之处1)放掉发酵液的同时也丢失了未利用的养分和处于生产旺盛期的菌体；2)定期补充和带放使发酵液稀释，送去提炼的发酵液体积更大；3)发酵液被稀释后可能产生更多的代谢有害物，最终限制发酵产物的合成；半连续发酵的不足之处4)一些经代谢产生的前体可能丢失；5)有利于非产生菌突变株的生长。据此，在采用此工艺时必需考虑上述的技术上限制，不同的品种应具体情况具体分析。连续培养连续培养是发酵过程中一面补入新鲜的料液，一面以相近的流速放料，维持发酵液原来的体积。连续培养连续培养系统又称为恒化器(chemostat)，因培养物的生长速率受其周围化学环境，即受培养基的一种限制性组分控制。连续培养微生物培养的动力学特性，它在恒化器中的行为可用一些常数，μmax，Ks，Y和Dcrit等描述。可采用的最大稀释速率受μmax值的影响；Ks值影响残留的基质浓度，从而影响菌浓与可利用的最大稀释速率；Y值也影响稳态菌体浓度。连续培养连续培养•临界稀释速率Dcrit值是指x=0，即细胞被洗出系统的稀释速率，可用式5-26表示：•Dcrit=μmaxS0/(Ks+S0)(5-26)•Dcrit受常数μmax，Ks和变量S0的影响。S0越大,Dcrit越接近μmax。但在一简单的恒化器中不可能达到μmax值，因总是存在着基质限制条件。连续培养连续培养连续培养应用•连续培养的方法筛选耐乙酸的高产菌株•在培养基中增加选择性压力，抗性菌株在培养中不断被富集多级连续培养多级恒化器的优点是在不同级的罐内存在不同的条件。这将有利于多种碳源的利用和次级代谢物的生产。多级连续培养如采用葡萄糖和麦芽糖混合碳源培养产气克雷白氏菌，在第一级罐内只利用葡萄糖，在第二级罐内利用麦芽糖，菌的生长速率远比第一级小，同时形成次级代谢产物。多级连续培养连续培养中存在的问题与分批发酵比较，连续发酵过程具有许多优点：在连续发酵达到稳态后，其非生产占用的时间要少许多，故其设备利用率高，操作简单，产品质量较稳定，对发酵设备以外的外围设备(如蒸汽锅炉，泵)的利用率高，可以及时排除在发酵过程中产生的对发酵过程有害的物质。但连续发酵技术也存在一些问题，如杂菌的污染，菌种的稳定性问题。连续培养中存在的问题•对基因工程重组菌而言，连续培养的周期还与质粒稳定性有关。连续培养中存在的问